Quantitative Real-time PCR

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1 Quantitative Real-time PCR Tecnica che consente la simultanea amplificazione e quantificazione del DNA target AMPLIFICAZIONE: prevede essenzialmente gli step di una classica PCR QUANTIFICAZIONE: effettuata aggiungendo composti la cui fluorescenza emessa ad ogni ciclo di reazione è proporzionale alla quantità di amplificato

2 Real-Time PCR: la reazione COMPONENTI DELLA REAZIONE: 1) DNA target 2) DNA polimerasi 3) Due oligonucleotidi 4) dntps 5) Fluorocromo

3 APPLICAZIONI Diagnosi malattie infettive Quantificazione patogeno RICERCA Espressione genica OGM

4 Perché Real-Time? Misura l amplificazione in tempo reale nella fase esponenziale

5 Curva di amplificazione PCR Target copy number Exponential phase Pateau phase cycle number

6 RT-PCR quantitativa La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazione viene rilevata e analizzata tramite computer Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR

7 Plot di amplificazione

8 Curve di amplificazione Fluorescenza Cicli di amplificazione Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di templato iniziale

9 Curva di amplificazione PCR 96 replicati di uno stesso campione danno quantità finali di c-dna molto diverse

10 Differenze quantificazione PCR convenzionale/real-time PCR PCR conv. Real-time PCR End-point No monitoraggio < Sensibilità Post-PCR Fase esponenziale Monitoraggio > Sensibilità No post-pcr

11 Strumentazione Real-time Termociclizzatore Sorgente laser Detector

12 Strumentazione Real-time

13 Strumentazione Real-time Q F 3 Tubulin 5 Q H 3 GapdH 5 Q TX 3 β-actin 5 Q Cy5 3 Cyclophilin 5

14 ANALISI REAL-TIME PCR Dopo ogni rilevamento, i segnali di fluorescenza sono processati da un software e la cinetica di formazione dell amplificato è visualizzata graficamente come incremento dei segnali di fluorescenza in ordinata (ΔRn) per cicli di reazione in ascissa ΔRn = Rn + - Rn - Rn + = int. fluor. R/int. fluor. Q al mom. rilev. Rn - = int. fluor. R/int. fluor. Q prima dell amplif.

15 CICLO THRESHOLD Il ciclo threshold (CT) è il ciclo della reazione di amplificatione nel quale il segnale di fluorescenza supera il valore di threshold Il threshold rappresenta quel valore di fluorescenza pari a 10 volte la ds della fluorescenza registrata nei primi cicli di amplificazione (background) Thre sho ld Baseline Sam ple C T

16 CICLO THRESHOLD Il C t di 96 replicati dello stesso campione mostra valori di fluorescenza quasi identici perché è calcolato in fase esponenziale

17 CICLO THRESHOLD È strettamente correlato al numero di copie iniziali del target Un numero iniziale di copie pari al doppio anticipa il C t di un ciclo Un numero iniziale di copie pari a metà posticipa il C t di un ciclo Due campioni che possiedono q di target diverse di 1 log hanno un DC t di 3,3 Si mantiene lineare con log di numero di copie iniziali che superano i 6-8 ordini di grandezza Which one has the The least? most?

18 QUANTIFICAZIONE ASSOLUTA: i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una curva standard) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA: la quantificazione viene effettuata paragonando i Ct Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una curva standard) Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro ΔC T con quello del controllo endogeno

19 QUANTITATIVA ASSOLUTA Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso costitutivamente (b-actina, GAPDH, ATPs, b2 etc)

20 CICLO THRESHOLD Il C t è un indicatore del numero di copie iniziali

21 CURVA STANDARD Amplificando in parallelo ai campioni a conc. non nota (unknown) degli standard esterni (a conc. nota) a diverse diluizioni, è possibile costruire una retta di regressione (curva di taratura o curva standard) Conoscendo il valore di C t, la conc. degli UKN si può ricavare per interpolazione ponendo il C t in ordinata e la conc. iniziale in ascissa

22 CURVA STANDARD

23 CURVA STANDARD Il sistema consente di valutare l efficienza di amplificazione mediante l analisi di tre parametri: 1.Slope (s): indica il n di cicli che intercorrono tra due diluizioni dello standard che differiscono di 1 log (teorico -3,3) 2.Coeff. correlazione (R): esprime le correlazioni esistenti tra i diversi segmenti che compongono la retta di regressione (teorico 1) 3. Intercetta nell asse (y): definisce il n di cicli necessari per rilevare 1 copia di DNA target

24 STANDARD Virus: ac. nucleico estratto da diluizioni log di sosp. virale titolata su cellule (TCID 50 /50ml, PFU) Per DNA: plasmide contenente il target, la cui conc. è stata determinata allo spettrofotometro (ng/ml) ed eventualmente trasformata in numero di copie Per RNA: plasmide trascritto in vitro; la conc. di RNA standard è determinata allo SF (ng/ml) ed eventualmente trasformata in numero di copie

25 QUANTITATIVA RELATIVA ΔC T Effettuata comparando i valori di Ct per determinare il cambiamento di espressione di un gene target in un campione rispetto ad un altro campione scelto come calibratore

26 QUANTITATIVA RELATIVA Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario: TARGET La sequenza di DNA da analizzare. CALIBRATORE Il campione da usare come riferimento per l analisi comparativa CONTROLLO ENDOGENO Un gene espresso costitutivamente in tutti i campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione

27 Quantitativa relativa: analisi dei dati Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente (ΔC T ) Comparare ciascun ΔC T così ottenuto con il ΔC T di un calibratore (cb) (ΔΔC T ) 2 -(ΔCT,r- ΔCT,cb) = 2 ΔΔCT Il valore così ottenuto permette di determinare la Concentrazione relativa del target

28 Step per il calcolo del 2- DDCT 1. Normalizzazione con un controllo endogeno (HK) Ct gene interesse Ct HK = ΔCt 2. Normalizzazione con il calibratore ΔCt Campione ΔCt Calibratore = ΔΔCt 3. Applicare la formula 2 -ΔΔCt

29 ESEMPIO Di quanto varia l espressione dell IL-10 tra Liver e Brain? 1. ΔCt Brain = 18 ΔCt Liver = ΔCt campione ΔCt calibratore = = ΔΔCT = 2 6 = 64 L IL-10 è 64 volte più espressa nel Liver rispetto al Brain!

30 Chimiche Real-time PCR Tutte le chimiche fanno uso di fluorocromi che emettono fluorescenza se eccitati da una luce a determinata λ Coloranti intercalanti " SYBR green " Etido bromuro Sonde specifiche ad ibridizzazione " TaqMan (sonde di ibridazione con idrolisi) " FRET " Molecular beacons (sonde di ibridazione senza idrolisi) " Scorpion (sonde incorporate nei primers)

31 COLORANTI INTERCALANTI EtBr emette fluorescenza 25 volte più intensa se legato a dsdna SYBR Green emette fluorescenza 200 volte più intensa se legato a dsdna

32 SYBR GREEN: principio Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA

33 SYBR GREEN L intercalante emette una bassa fluorescenza quando non è legato a dsdna Durante l estensione SYBR Green si lega a dsdna: il segnale aumenta Durante la denaturazione SYBR Green torna in soluzione: il segnale dimunisce

34 SYBR Green E un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni. DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza Primer SYBR Green ANNEALING L intensità della fluorescenza comincia ad aumentare Luce emessa ALLUNGAMENTO L intensità della fluorescenza continua ad aumentare e diventa massima al termine della fase di allungamento Polimerasi L AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E REGISTRATO A 530 nm

35 SYBR GREEN Primers d. NTPs Intercalation Dyes Thermal Stable DNA Polymerase Add Master Mix and Sample Reaction Tube 3 λ Taq ID Denaturation Annealing

36 SYBR GREEN Extension 3 5 ID ID Taq 5 Taq ID ID λ λ λ ID ID ID ID 5 Taq 5 Extension Continued Apply Excitation Wavelength Taq λ ID λ ID 5 3 Repeat

37 SVANTAGGI Specificità è data solo dai primers La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici VANTAGGI Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa

38 Curva di melting alla fine della reazione Misurazione della fluorescenza durante il progressivo aumento T > Tm target Alla T alla quale i filamenti di DNA si separano, il segnale precipita Il modo più semplice di programmare una curva di melting consiste nell aumentare gradatamente la temperatura (0.5 C per ciclo)

39 SYBR GREEN Due modi per analizzare la curva di melting la diminuzione della fluorescenza con l aumentare della temperatura il tasso di dimuzione della fluorescenza nel tempo

40 Diminuzione della fluorescenza con l aumentare della temperatura SYBR GREEN

41 Tasso di dimuzione della fluorescenza nel tempo SYBR GREEN aspecific o specifico

42 SONDE DI IBRIDAZIONE Sonde di ibridazione con idrolisi TaqMan Sonde di ibridazione senza idrolisi Molecular Beacons Dual oligo FRET probes Sonde incorporate nei primers Amplifluor Scorpions

43 TAQMAN PROBES Il sistema TaqMan è costituito da 2 primers + 1 sonda (probe) Sfrutta l attività 5-3 esonucleasica di alcune polimerasi (Taq, Tth, Tfl) Il probe è costituito da un oligonucleotide marcato con fluorocromi alle estremità 5 e 3 Fluorocromo 5 REPORTER Fluorocromo 3 QUENCHER Quando la sonda non è ibridata, Q assorbe la fluorescenza di R ed il sistema è silente

44 TAQMAN PROBES Principio di Forster del trasferimento dell energia R Q Q R

45 TAQMAN PROBES Primers d. NTPs Thermal Stable DNA Polymerase R Probe 5 3 Q Add Master Mix and Sample Reaction Tube 3 Taq 5 3 λ R Q Denaturation Annealing

46 TAQMAN PROBES Q R R Q R 3 Taq 5 3 R 5 Extension Step 1. Strand Displacement 3 Q Taq Cleavage Taq Taq R λ R 5 3. Polymerization Complete 4. Detection

47 TAQMAN PROBES Vantaggi Il sistema TaqMan produce un robusto segnale cumulativo Chimica più utilizzata in real-time Mix precostituite per molti saggi TaqMan Svantaggi Il quencher emette fluorescenza Elevato background Specificità alta, ma inferiore rispetto a beacon

48 TAQMAN PROBES Disegno di primers e probe º Amplicone di bp (+ facile denaturazione) º Tm probe = C (10 C > Tm primers) º Tm primers = C º No G all estremità 5 del probe

49 TAQMAN PROBES Effetto della lunghezza dell amplicone sull efficienza di reazione Stessa sonda, stesso DNA-target, stessa [ ] di DNA TC = 19.4 TC = 20.9 Primers studiati per RealTime PCR: I primers amplificano un segmento di 79 basi del transgene TSWV-N Primers utilizzati in PCR tradizionale: I primers amplificano un segmento di 273 basi del transgene TSWV-N

50 File termico Poiché l idrolisi della sonda avviene solo se questa è ibridata al target, l estensione dovrebbe avvenire a T compatibili con la Tm della sonda Molti sistemi TaqMan utilizzano due soli step: 1. denaturazione a 94 C 2. annealing/extension a 60 C

51 SONDE MINOR GROOVE BINDER (MGB) Aumento della stabilita termodinamica Riduzione della lunghezza della sonda (12-18 basi) Incremento della specificita snps diidrociclopirroloindolocarbossilato tripeptide, CDPI3

52 PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2) VARIAZIONE NEL GENE DELLA PROTEINA DEL CAPSIDE

53 PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2) DISEGNO DI PRIMERS E SONDE MGB Test 2a/2b CPVa/b-For Test 2b/2c CPVb/c For CPVa/b-Rev CPVb/c Rev CPVa-Pb (marcata con VIC) (marcata con FAM) CPVb1-Pb (marcata con FAM) (marcata con VIC) CPVb2-Pb CPVc-Pb 4062A G 4064T A

54 MOLECULAR BEACONS Possiedono una struttura stem and loop Il loop è costituito da una regione complementare alla sequenza target Lo stem è costituito da due braccia complementari tra di loro, marcate rispettivamente con reporter e quencher

55 MOLECULAR BEACONS Lungh. braccia = 4-7 bp Tm loop = C Tm braccia =2-5 C<Tm loop Tm primers=58-60 C

56 MOLECULAR BEACONS In soluzione il beacon assume una forma a forcina (hairpin), a causa della elevata complementarietà tra le basi delle braccia QUENCING Quando è ibridato al target, il beacon assume conformazione lineare FLUORESCENZA

57 MOLECULAR BEACONS Primers d. NTPs Thermal Stable DNA Polymerase Molecular Beacon Add Master Mix and Sample Reaction Tube R Q 3 Taq 5 3 Annealing 5 R Q 5 3 Denaturation

58 MOLECULAR BEACONS λ Q R Detection Taq 5 3 Taq 3 Q R 5 Molecular Beacon 5 3 R Q Extension Step 1. Strand Displacement 2. Polymerization Complete Probe Silent

59 MOLECULAR BEACONS Vantaggi Alta specificità (1 nt) Basso background Svantaggi I beacon non producono un robusto segnale cumulativo Difficoltà nel disegno del beacon

60 FRET PROBES Utilizzano due sonde diverse che ibridizzano al target in modo che l estremità 5 della prima sia vicina alla estremità 3 della seconda (ibridazione testa-coda) La prima sonda reca alla estremità 5 un fluoroforo (donatore) la cui emissione è silente, ma capace di eccitare il fluoroforo presente alla estremità 3 dell altra sonda Solo l emissione del secondo fluoroforo è captata dal detector

61 Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però due sonde ognuna marcata con un solo fluorocromo (accettore e donatore) Quando le sonde non sono legate alle sequenze target il segnale fluorescente proveniente dall'accettore non è rilevato donatore accettore Durante lo step di annealing PCR, entrambe le sonde FRET ibridizzano alle sequenze target: ciò avvicina il fluoroforo donatore all'accettore permettendo il trasferimento di energia tra i due fluorofori e la produzione di un segnale fluorescente da parte dell'accettore che viene rilevato

62 R FRET PROBES 3 l D R bases D R Taq Detection Extension Step 1. Strand Displacement System Silent Taq 2. Polymerization Complete System Silent