FluoroSpheres Codice n. K0110

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1 FluoroSpheres Codice n. K0110 Quinta edizione Sfere di calibrazione per il monitoraggio giornaliero della citometria a flusso. Il kit contiene i reagenti per 40 calibrazioni. ( ) K0110/IT/TJU/ p. 1/9

2 Indice Pagina Uso previsto... 3 Sommario e note esplicative... 3 Principio della procedura... 3 Reagenti... 4 A. Materiali forniti... 4 B. Materiali necessari, ma non forniti... 4 Conservazione... 4 Procedura d analisi e acquisizione di dati... 5 Analisi dei dati e curva di calibrazione... 5 A. Definizioni... 6 B. Calibrazione manuale. Per strumenti che esprimono la MFI in valori lineari C. Calibrazione manuale. Per strumenti che esprimono la MFI in numeri di canali... 7 ( ) K0110/IT/TJU/ p. 2/9

3 Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. FluoroSpheres è destinato al monitoraggio della prestazione della citometria a flusso. Sommario e note esplicative Il kit fornisce Blank Beads e Calibration Beads di 3,2 µm. Le Calibration Beads sono una miscela di 5 popolazioni di sfere con diversa intensità di fluorescenza e una popolazione di sfere non fluorescenti. Nelle sfere fluorescenti si trova intrappolata una combinazione di fluorocromi unici che permettono l eccitazione con la luce a qualsiasi lunghezza d onda compresa tra 365 e 650 nm. I fluorocromi delle sfere sono diversi dai fluorocromi normalmente utilizzati, quindi le proprietà dello spettro sono diverse. Ne risulta che le sfere non possono essere utilizzate per stabilire la compensazione della fluorescenza. Grazie ai valori assegnati alle molecole di fluorocromo equivalente (MEF) per le popolazioni di sfere fluorescenti, l uso di FluoroSpheres rende possibile la trasformazione di unità arbitrarie di intensità media di fluorescenza (MFI) in unità assolute per la sicurezza della qualità e il resoconto dei dati della citometria a flusso. Principio della procedura 1. Inizialmente sono analizzate le Blank Beads per stabilire le impostazioni ottimali dello strumento per tutti i canali di interesse. 2. Poi sono analizzate le Calibration Beads. I dati sono utilizzati per la costruzione della curva di calibrazione, dove la MFI è posta in grafico contro la MEF. La curva di calibrazione e i parametri statistici associati sono utilizzati per valutare la linearità dello strumento. Inoltre dalla curva di calibrazione possono anche essere determinati la soglia di rilevamento e l intervallo dinamico dello strumento. ( ) K0110/IT/TJU/ p. 3/9

4 La calibrazione con FluoroSpheres può essere eseguita in due modi: Impostazione costante dello strumento. Con questo metodo tutte le impostazioni dello strumento rimangono immutate nel tempo. Sono misurate le MFI per i vari picchi e i risultati sono visualizzati come dati di calibrazione contro MFI. Risposta costante dello strumento. Con questo metodo il voltaggio del PMT è regolato in modo che la MFI di uno dei picchi di alta fluorescenza appaia sempre nello stesso canale ogni volta. I risultati sono visualizzati come dati di calibrazione contro il voltaggio del PMT. Reagenti A. Materiali forniti Fiala 1 1,7 ml In azide sodica 0,02%, NP40 0,01% Fiala 2 1,7 ml Contiene Blank Beads e 5 popolazioni di sfere con diverse quantità di fluorocromi espresse in valori delle MEF per FITC, RPE, RPE- TxRed, RPE-Cy5 e APC, rispettivamente. Per i valori delle MEF lotto-specifici, consultare la Scheda dei valori analitici inclusa. In azide sodica 0,02%, NP40 0,01% B. Materiali necessari, ma non forniti Attrezzatura generale di laboratorio per le procedure di citometria a flusso. Carta semi- e doppio-logaritmica a 5 cicli. Calcolatrice. Programmi software per l analisi della citometria a flusso. Programmi per fogli elettronici, come Microsoft Excel. Questi programmi sono opzionali. Precauzioni 1. Per operatori specializzati. 2. Il prodotto contiene azide sodica (NaN 3 ), una sostanza chimica altamente tossica in forma pura. Alle concentrazioni indicate, il prodotto non è classificato come pericoloso, ma l azide sodica potrebbe reagire con le tubature in piombo e in rame formando accumuli altamente esplosivi di azidi metalliche. Per lo smaltimento del prodotto, è consigliabile sciacquare abbondantemente con acqua per evitare l accumulo di azidi metalliche nelle tubature. Conservazione Conservare il kit a 2-8 C. Non usare dopo la data di scadenza indicata sulle fiale. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate, l utente deve verificarne le condizioni. Se si dovessero osservare risultati inattesi non attribuibili a modifiche delle procedure di laboratorio e si sospetta un problema relativo al kit, contattare il Servizio tecnico. ( ) K0110/IT/TJU/ p. 4/9

5 Procedura d analisi e acquisizione di dati 1. Mischiare le sfere abbondantemente con il vortex o a mano. 2. Aggiungere 0,5 ml di tampone di diluizione adatto, per esempio soluzione salina a tampone fosfato, ph 7,2 a ognuna delle due provette del test. Aggiungere una goccia dalla fiala 1, Blank Beads, alla prima provetta e una goccia dalla fiala 2, Calibration Beads, alla seconda provetta. Mischiare con il vortex in modo che le sfere siano in sospensione. 3. Prima dell acquisizione dei dati, si seleziona l amplificazione logaritmica per i rilevatori di fluorescenza di interesse e si imposta su 0 la compensazione della fluorescenza per tutti i parametri. 4. Caricare la provetta con le Blank Beads sul citometro a flusso. 5. Regolare il voltaggio del PMT per permettere al picco delle Blank Beads di apparire nella prima decade nell istogramma. 6. Utilizzando la diffusione anteriore contro la diffusione laterale, impostare un live gate (gate entrante) sui singoletti delle sfere (vedere figura 1). 7. Acquisire un minimo di 5000 eventi circoscritti delle Blank Beads. 8. Caricare il tubo con le Calibration Beads sul citometro a flusso e acquisire i dati per un minimo di 5000 eventi circoscritti. 9. Nel canale della fluorescenza di interesse dovrebbero essere visibili sei picchi di diversa intensità di fluorescenza (vedere la figura 2) Analisi dei dati e curva di calibrazione L analisi dei risultati è limitata ai singoletti di sfere circoscritti, liberi da debris, come definito dal dot plot della diffusione anteriore verso la diffusione laterale (vedere figura 1). Sono utilizzati dei marker individuali o delle regioni per definire ognuna delle sei popolazioni di sfere delle Calibration Beads (vedere la figura 2). Le regioni sono usate per determinare la MFI di ogni popolazione di sfere. Figura 1. Diffusione anteriore contro diffusione laterale delle Blank Beads. Il gate è stato impostato per raccogliere i singoletti delle sfere. ( ) K0110/IT/TJU/ p. 5/9

6 855 R5 R6 R3 R4 641 R2 R1 Counts FL1-H Figura 2. Istogramma delle popolazioni delle sfere FluoroSpheres. A. Definizioni Sfasamento logaritmico Lo sfasamento logaritmico rappresenta il valore di fluorescenza nel canale 0. Il canale 0 generalmente è rappresentato nel software del produttore da valori arbitrari, ad es. 1 per molti software Becton Dickinson e 0,1 per molti software Coulter. AvgRes% La percentuale residua media (Avg/Res%) è una misura non ponderata della linearità di risposta dello strumento. È calcolata determinando la percentuale assoluta media, la retta di regressione varia dal punto attuale. r 2 Il coefficiente di determinazione (r 2 ) è una misura ponderata della linearità. È molto utile nell analisi dei dati logaritmici. Soglia di rilevamento Anche se le Blank Beads non hanno fluorocromi intrappolati, possono dare origine a un segnale. Questo segnale rappresenta il rumore di fondo e quindi il livello di rilevamento dello strumento. MEF Molecole di fluorocromo equivalente rappresentano la quantità di fluorocromo per sfera. Decade logaritmica La decade logaritmica è l intervallo calibrato completo, o intervallo dinamico, del parametro fluorescente che si sta calibrando. Generalmente i citometri a flusso presentano amplificatori con un intervallo dinamico di 3,5 o 4 decadi logaritmiche, a seconda del produttore. Una riduzione della prestazione del citometro a flusso influisce sulla decade logaritmica. B. Calibrazione manuale. Per strumenti che esprimono la MFI in valori lineari. Costruzione della curva di calibrazione: 1. Determinare la MFI per ognuna delle 6 popolazioni di FluoroSpheres Calibration Beads. ( ) K0110/IT/TJU/ p. 6/9

7 2. Porre su un grafico la MFI contro la corrispondente MEF logaritmica per i diversi picchi. Calcolare la retta di "miglior adattamento" secondo la seguente formula: log (MEF) = a x log (MFI) + b dove a è la pendenza e b l intercetta dell asse y, anche chiamata sfasamento logaritmico o valore del canale Calcolare i parametri statistici associati: AvgRes% e r 2 della curva di calibrazione. 4. L intervallo dinamico dell amplificatore è espresso in decadi logaritmiche. Le decadi logaritmiche possono essere calcolate dalla retta di regressione con la sottrazione del log (MEF min ) dal log (MEF max ). Il Log (MEF min ) e il log (MEF max ) sono derivati dai valori MFI più bassi e più alti, rispettivamente. In questo caso le MFI per MEF min e MEF max sono 10 0 e 10 4, rispettivamente. Figura 3. Curva di calibrazione (retta di regressione) basata su FluoroSpheres. Esempio del calcolo: decadi logaritmiche = log (MEF max ) - log (MEF min ) decadi logaritmiche = log ( ) - log (30,8) decadi logaritmiche = 5,28 1,49 decadi logaritmiche = 3,79 Canali per decade: Il numero di canali è 1024, quindi il numero di canali per decade è: 1024/3,79 = 270 C. Calibrazione manuale. Per strumenti che esprimono la MFI in numeri di canali. Costruzione della curva di calibrazione: 1. Determinare la MFI per ognuna delle 6 popolazioni di FluoroSpheres Calibration Beads. 2. Porre su grafico la MFI contro log (MEF) e calcolare la retta di "miglior adattamento" secondo la seguente formula: log (MEF) = a x MFI + b dove a è la pendenza e b l intercetta dell asse y. 3. Calcolare i parametri statistici associati: AvgRes% e r 2 della curva di calibrazione. ( ) K0110/IT/TJU/ p. 7/9

8 4. L intervallo dinamico dell amplificatore è espresso in decadi logaritmiche. Le decadi logaritmiche possono essere calcolate dalla retta di regressione con la sottrazione del log (MEF min ) dal log (MEF max ). Il Log (MEF min ) e il log (MEF max ) sono derivati dai valori MFI più bassi e più alti, rispettivamente. In questo caso le MFI per MEF min e MEF max sono 0 e 1023, rispettivamente. Figura 4. Curva di calibrazione (retta di regressione) basata su FluoroSpheres. Esempio del calcolo: decadi logaritmiche = log (MEF max ) - log (MEF min ) decadi logaritmiche = log ( ) - log (30.8) decadi logaritmiche = decadi logaritmiche = 3.79 Canali per decade: Il numero di canali è 1024, quindi il numero di canali per decade è: 1024/3.79 = 270 ( ) K0110/IT/TJU/ p. 8/9

9 Legenda dei simboli Numero di catalogo Limiti di temperatura Fabbricante Dispositivo medicodiagnostico in vitro. Consultare le istruzioni per l uso Codice del lotto Utilizzare entro. Prodotto da: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danimarca Tel Fax ( ) K0110/IT/TJU/ p. 9/9