Metodi di analisi di OGM

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1 Metodi di analisi di OGM Roberta Onori Istituto Superiore di Sanità Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari

2 Quadro normativo Attività Pre-marketing Indag ini sulla esposizione metodi di analisi Controllo ufficiale Attività Post- marketing Autocontrollo

3 Ditte produttrici Metodi di analisi degli OGM Per verificare le caratteristiche molecolari e la segregazione dell OGM Per monitorare la modificazione genetica mella produzione di ibridi Idustrie alimentari, mangimistiche e sementiere Per garantire la tracciabilità dei prodotti Per garantire il rispetto delle normative vigenti Autorità Competenti Per l attuazione del controllo ufficiale da parte dei laboratori competenti Laboratori privati Per fornire servizio analitico ai richiedenti

4 Elementi che permettono di individuare la presenza di OGM Presenza del transgene Presenza della proteina espressione del transgene inserito Bt toxin crystals

5 METODI ANALITICI per la DIAGNOSTICA degli OGM DNA PCR PROTEINE Tecniche IMMUNOENZIMATICHE (ELISA)

6 Metodi ELISA per la determinazione delle proteine proteine Signal development Recognition Sites (Epitopes) Enzima coniugato Anticorpi Anticorpo di cattura

7 Applicazione di metodi immunologici agli OGM Metodi rapidi qualitativi Metodi quantitativi Soia RR e colza Mais Event 176 Mais Bt 11

8 Metodi rapidi Reservoir Pad Result Window Reagent Flow Labelled Filter Cover Lateral Flow Device Schematic Reagent Flow Single band Negative Result Reagent Flow Two bands Positive Result

9 Metodi quantitativi ELISA Step 1. Step 2. Campione Aliquota da analizzare Step 5. Data analysis Step 4. Estrazione delle proteine Step 3. Dispensazione dell estratto nei pozzetti della piastra

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11 Kit commerciali per l analisi di OGM BT Cry 1A(b)

12 Metodi ELISA SVANTAGGI VANTAGGI Materie prime o prodotti non sottoposti a procedimenti tecnologici in grado di denaturare le proteine Impossibilità di discriminare OGM diversi che esprimono la stessa proteina Non esiste perfetta correlazione fra proteina espressa e % di materiale OGM Bassi costi rispetto PCR Velocità del saggio Semplicità delle operazioni (effettuabili anche su campo TEST STRIP)

13 Metodi basati sul DNA WT mrna mrna Proteina - enzima Proteina - enzima metaboliti P E Gene T metaboliti OGM P E Gene T mrna mrna mrna Proteina - enzima Proteina - enzima Proteina - enzima metaboliti metaboliti metaboliti

14 Metodi basate sul DNA

15 Fasi analitiche di un metodo diagnostico basato sulla PCR Preparazione del campione Estrazione del DNA Valutazione quali-quantitativa del DNA Preparazione dei reattivi della PCR PCR Amplificato

16 Materie prime semi (CEN) Omogeneizzazione/Macinazione Aliquota 1 Aliquota 2 Aliquota 3 Aliquota 4 Preparazione Campione Laboratory Sample O m o g e n e i t à R a p p r e s e n t a t i v i t Alimenti processati 2 pacchetti 1 merendina 1 merendina Omogeneizzazione/Macinazione à Aliquota 1 Aliquota 2 Aliquota 3 Aliquota mg 1-2 g Conservare a 20 C Test Portion Estrazione DNA Conservare a 20 C

17 Estrazione del DNA Strumentazione (ambiente dedicato) Bagno termostatato Vortex mixer Centrifuga Reagenti e materiali monouso Provette tipo eppendorf da 2 e 1,5 ml Rack Reattivi per l estrazione (prodotti per biologia molecolare) Kit di purificazione Acqua sterile Puntali sterili con filtro Pipette automatiche dedicate

18 La PCR Reazione a Catena della Polimerasi DNA dntps Primers PCR tampone + MgCl 2 Taq DNA polymerase

19 Steps in a PCR Cycle Denaturation (90-95 º C) Primer Annealing (40-70 º C) Extension (72 º C)

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22 La PCR Reazione a Catena della Polimerasi Curve di amplificazione Numero di molecole di DNA Numero di cicli

23 Metodi PCR per l analisi di OGM DNA della pianta gene A gene B DNA della pianta PCR specifica pianta PCR specifica construtto PCR specifica del gene PCR di screening PCR specifica della specie evento specifico costrutto gene OGM O non OGM DNA amplificabile

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25 Al DNA si aggiunge una soluzione colorata contenente un addensante che ne facilita il caricamento su un gel di agarosio.

26 Analisi dell amplificato MWM 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c MWM Zeina (specifico del mais) Lectina (specifico della soia) MWM = Marker Triplicati 1 = Mais 0% OGM 4 = Mais MON % OGM 2 = Mais Bt % OGM 5 = Soia 0% OGM 3 = Mais Bt % OGM 6 = SoiaRR 100% GMO

27 Analisi dell amplificato MWM C MWM 437 bp (Bt-11) 194 bp (MON810) 120 bp (Bt-176) MWM = Marker (Low Ladder 100 bp) C = No Template Control 1 = MON % OGM 5 = MON810 + Bt % OGM 2 = Bt % OGM 6 = Bt Bt % OGM each 3 = Bt % OGM 7 = MON810 + Bt-11 + Bt % OGM each 4 = MON810 + Bt % OGM

28 GMO? Yes/No Positive Negative Yes No 0.5% tolerance Illegal Are they Authorised? Yes/No Assay individual ingredients 0.9% threshold Must be Labelled? Yes/No Less than 0.9% More than 0.9% No need for labelling Labelling required

29 Metodi quantitativi per l analisi di OGM DNA Analisi strumentale: REAL TIME PCR Monitoraggio in TEMPO REALE dell andamento della PCR Proteine Metodi immunoenzimatici ELISA Raccomandazione EU 787/04 Percentuale di DNA geneticamente modificato: percentuale delle copie di DNA geneticamente modificato rispetto alle copie di DNA specifico del taxon bersaglio, calcolata in termini di genomi aploidi

30 Sonde di ibridizzazione

31 SONDA ad IDROLISI TaqMan Reporter (FAM,VIC, TET) (Fluoresceina) 5 Fam Vic Tet Trasferimento di energia Quencher (TAMRA) (Rodamina) Gruppo Fosfato 3 Laser Excitation

32 TaqMan Fluorogenic Probe Reporter (FAM,VIC, TET) (Fluoresceina) Quencher (TAMRA) (Rodamina) 5 Fam Vic Tet Distacco della sonda Laser Excitation Gruppo fosfato 3

33 CHIMICA TaqMan Denaturazione Annealing Polimerizzazione R = Reporter (FAM, VIC) 5 3 forward primer R Q Q Q = Quencher (TAMRA)

34 Taqman PCR Chemistry Denaturation Annealing Polymerization R = Reporter Q = Quencher forward primer R Q Q 5 3 5

35 Taqman PCR Chemistry R = Reporter Q = Quencher R Q Q forward primer reverse primer

36 Taqman PCR Chemistry Denaturation Annealing Polymerization R = Reporter Q = Quencher forward primer R Q Q 5 3 5

37 . Taglio della sonda Emissione di fluorescenza forward primer R Q Q R = Reporter Q = Quencher Intensità di Fluorescenza Campione positivo Controllo negativo 1st cycle 5th cycle 10th cycle 15th cycle 20th cycle 25th cycle 30th cycle 35th cycle 40th cycle 45th cycle 50th cycle EMISSIONE del REPORTER EMISSIONE del QUENCHER 0 1 wave length (nm) Lunghezza d onda

38 REAL-TIME PCR Permette di seguire la cinetica della PCR mentre è in atto: DURANTE LA FASE ESPONENZIALE Campioni vengono irradiati da una sorgente luminosa FLUORESCENZA Fluorescenza viene rivelata da una CCD camera sotto il controllo del computer Cicli VANTAGGI Riduzione dei tempi di esecuzione dell analisi Elimina manipolazioni successive all amplificazione (minore possibilità di contaminazione tra campioni) Elimina l impiego di reagenti radioattivi o tossici (EtBr)

39 SISTEMA DI QUANTIFICAZIONE Linea di base della curva Non è ancora misurabile Rn Linea soglia Taglia la curva del campione in fase di crescita esponenziale Ciclo soglia (Ct) Ciclo in cui la curva di amplificazione del campione in fase esponenziale taglia la linea soglia

40 0.5% OGM 1%OGM Linea threschold 5%OGM 0.1%OGM

41 Layout della piastra S1 S1 S1 S2 S2 S2 S3 S3 S3 S4 S4 S4 A A A A 1:10 A 1:10 A 1:10 B B B B 1:10 C+ C+ C+ C- C- C- NTC NTC NTC B 1:10 B 1:10 EN DO GE NO S1 S1 S1 S2 S2 S2 S3 S3 S3 S4 S4 S4 O A A A A 1:10 A 1:10 A 1:10 B B B B 1:10 B 1:10 B 1:10 G M C+ C+ C+ C1 C1 C1 NTC NTC NTC C+ controllo positivo C- controllo negativo NTC Amplification reagent control

42 ANALISI QUANTITATIVA OGM QUANTIFICAZIONE RELATIVA DNA SPECIE VEGETALE (lectina, invertasi, zeina, HMG) DNA GM (Soia RR, mais Bt 176-Bt 11 etc) DNA soia RR DNA soia % OGM X 100

43 ANALISI QUANTITATIVA OGM Quantificazione relativa Calcolata sull sull INGREDIENTE DNA della SPECIE VEGETALE SOIA (lectina) DNA GM della Soia RR (EPSPS) %OGM = DNA GM DNA specie

44 CALCOLO DEL CONTENUTO IN OGM Curva di calibrazione costruita con CRM (soia RR Fluka 0,1-0, % RR) 1 Curva : mette in relazione la differenza in cicli soglia tra target e riferimento in funzione del log %OGM Ct (OGM)-Ct(Lectina) = a log (% OGM) + b Ct 20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00-1,5-1 -0,5 0 0,5 1 log (% OGM)

45 Metodo della curva standard copie genomiche 2 curve di calibrazione (transgene + gene di riferimento) basate sul numero di copie genomiche Raccomandazione EU 787/04 Percentuale di DNA geneticamente modificato: percentuale delle copie di DNA geneticamente modificato rispetto alle copie di DNA specifico del taxon bersaglio, calcolata in termini di genomi aploidi Ct 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 y = x R 2 = y = x R 2 = ,0 Copie genomiche soia RR Copie genomiche soia x100 0,0 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 log(10) copie genomiche

46 LOD valore al di sotto del quale il metodo non consente di determinare la presenza del parametro analizzato 1 copia 20 copie %OGM 0.001% (teorico) 0.01% (pratico) LOQ indica il limite al di sotto del quale il metodo non consente di determinare l esatta concentrazione del parametro analizzato %OGM 0.01% (teorico) 0.1% (pratico)

47 Principi di Base Miniaturizzazione e automazione di saggi biologici centinaia di migliaia di geni usati come sonde su una superficie di 2-3 cm Le sonde vengono attaccate su un supporto solido Con l aiuto della Robotica L informatica è una componente centrale in tutti gli step

48 Tecniche Innovative Extraction of DNA Selective amplification (marker sequences) and labelling Food sample Activated glass surface with fixed specific capture probes Hybridisation of PCR products Diagnosis : presence of sequences specific to the GMO

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51 Latest GMOchips design +hy Ctl3µM + hy Ctl 187.5nM + hy Ctl 1.5µM + hy Ctl 93.75nM + hy Ctl 750nM + hy Ctl nM + hy Ctl 375nM + hy Ctl 23.44nM + hy Ctl 11.72nM + hy Ctl 5.86nM -hy Ctl -hy Ctl Bt11 Bt176 GA21 Mon810 T25,T45,Topas RRS Starlink a Starlink d Starlink e Starlink f OXY235-1 OXY235-2 OXY235-3 Tomato Mais Soybean Rapeseed Sugar beet P35S test Tnos test nptii test CaMV test (a) CaMV test (b) EF Bt11 EF Bt176 EF GA21 EF T25 EF RRS EF Starlink Pat gene EF Mon810 buffer buffer Fix Ctl 2.5nM Fix Ctl 5nM Fix Ctl 10nM Fix Ctl 20nM Fix Ctl 40nM Fix Ctl 80nM Fix Ctl 160nM

52 GMOchips T25 Mais Pos Hyb CTL Neg Hyb CTL Specific capture probes for Bt11 Capture probe for Pat gene Specific capture probes for T25 Specific capture probes for Mon810 Pos Fix CTL Specific capture probes for Bt176 Specific capture probes for GA21 Specific capture probe for Capture RRS probe for P35S