ABI-7700 User Bulletin #5

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2 ABI-7700 User Bulletin #5

3 1. halogen tungsten lamp 2b. emission filters 3. intensifier 5. ccd detector 350,000 pixels 2a. excitation filters 4. sample plate 3

4 Real-time qpcr - La fluorescenza aumenta ad ogni ciclo in maniera proporzionale alla quantità di prodotto.

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8 Comparing Ct Values

9 Curva di dissociazione Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione

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11 FRET

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13 * stessa Tm (58-60 C) * basi di lunghezza * contenuto in G+C del 30-80% * no runs di 4 o più Gs (o altri nucleotidi) * non più di due G+C all'estremità 3 * nessuna G all'estremità 5' * dimensioni dell'amplicone bp * scegliere le giunzioni esone esone nel cdna

14 Quenchers: Dark Quenching Molecole che hanno la massima sovrapposizione di spettro con il fluoroforo e non hanno una fluorescenza nativa (da qui il nome dark)

15 FRET il quencher è quasi sempre il Dabcyl multiplex

16 Al terminale 5 del probe vi è il fluoroforo mentre al terminale 3 vi è una sequenza (PCR primer) che è specifica per l estensione del target. Il probe è legato al terminale 5 del PCR primer per mezzo di un blocker. Il Quencer si trova al 3 di un oligo complementare alla sequenza del probe.

17 Sonde d Ibridazione donatore accettore

18 EFFICIENZA La pendenza delle log-linear phase riflette l efficienza di amplificazione L efficienza di una reazione può essere calcolata con la seguente equazione: Eff = 10 (-1/slope) - 1 L efficienza di una PCR ottimale dovrebbe essere circa % (pendenza ideale = -3.3) Un gran numero di variabili possono influenzare l efficienza della PCR. Tra questi fattori vi sono la lunghezza degli ampliconi, le strutture secondarie, i primer stessi etc.

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21 X n = X 0 (1+E) n X n = prodotto di PCR dopo il ciclo n; X 0 = numero iniziale di copie E = efficienza di amplificazione n = numero di cicli

22 Quantificazione ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i C T Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve) Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro ΔC T con quello del controllo endogeno

23 Ct unknown sample copies Log 10 quantity

24 Albumin (ALB) gene dosage by real-time PCR The copy number of ALB (x) can be calculated as follows: y = x , where the C t value is substituted as y.

25 Plot di amplificazione Control Sample Numero di cicli ΔC T

26 Quantizzazione assoluta curva standard, possibilmente con lo stesso DNA accuratezza nella quantizzazione dello standard Es. utile per la determinazione della carica virale di un campione Quantizzazione relativa curva standard con un controllo interno diluizioni seriali di uno standard (hk gene) Es. utile per studi di espressione genica Fold = 2 ΔCt Quantizzazione comparativa determinazione matematica il campione di riferimento (controllo vs hk gene) è considerato 1x Es. serve per verificare il trends di un analisi Fold Change = 2 ΔΔCt

27 Quantizzazione Comparativa - metodo del ΔΔCt control RPLP0 con av =19.93 IL1-b con av =29.63 experiment IL1-b vit RPLP0 vit av =18.03 av =19.80

28 Fold = 2 ΔCT (assumendo efficienza del 100%) 2 ΔΔCt esprime la variazione del templato nelle due condizioni (assumendo efficienza del 100%) Fold change = = 2702 ma l'efficienza x IL1-beta è 96% Fold change = = 1800

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31 Methylation detection

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33 Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche.

34 Perché studiare l espressione della tirosina Idrossilasi (TH) Le cellule di Neuroblastoma (NB) sintetizzano catecolamine il cui valore è alterato nel 95% dei pazienti. La TH è uno dei marker tumorali tessuto-specifici espresso dalle cellule di NB, ma non dagli altri tumori a piccole cellule rotonde. Anche i valori di HVA e VMA sono notevolmente aumentati. Pertanto l espressione di questo enzima può essere utilizzata per identificare le metastasi midollari al momento della diagnosi e per monitorare lo stato della MRD (Minimal Residual Disease) in modo da individuare eventuali segnali precoci di ricaduta in pazienti in remissione clinica.

35 Enzima che catalizza la prima reazione di biosintesi delle catecolamine TH (Tirosina Idrossilasi)

36 Rilevazione di diversi retrovirus umani mediante Multiplex Real-Time PCR Primer x amplificare: Gene gag di HIV-1 Gene env di HIV-2 Gene tax di HTLV-1 Gene pol di HTLV-2 Usati beacon diverse associate a fluorofori specifici

37 Single-gene copy numbers Barrois M et al. Clin Genet 2004 (www)