DIPARTIMENTO DI SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMEDICHE

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1 DIPARTIMENTO DI SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMEDICHE Istituto di Genetica UNIVERSITA DEGLI STUDI DI UDINE Address: Istituto di Genetica DSTB - Università degli Studi di Udine P.le Kolbe, Udine - ITALIA Tel: Fax: AGGIORNAMENTO DEL PROGETTO BIOTECNOLOGICO RIGUARDANTE ASPETTI DIAGNOSTICI E PROGNOSTICI NELL AMBITO DELL ATROFIA MUSCOLARE SPINALE Il progetto di ricerca di cui sopra consente attualmente di poter offrire ai soggetti appartenenti a famiglie SMA, le seguenti valutazioni diagnostiche / prognostiche: 1. Diagnosi molecolare di affetto SMA, mediante ricerca di delezione dell esone n. 7 e/o dell esone n. 8 di entrambe le copie del gene SMN1. 2. Diagnosi molecolare di portatore sano di delezione dell esone n. 7 e/o dell esone n. 8 del gene SMN1. 3. Valutazione del numero di copie del gene SMN2, modulatore del fenotipo patologico (Wirth et al 2006). 4. Valutazione quantitativa dell espressione totale dei geni SMN e del messaggero produttore di proteina full-length, ossia intera che include l esone n. 7 (Lorson and Androphy, 2000). 5. Valutazione dei livelli di espressione della plastina 3 (PLS3), a possibile ruolo neuroprotettivo, per i soggetti asintomatici con delezione di entrambe le copie del gene SMN1 (Oprea et al. 2008). Nessuno dei tests molecolari di cui sopra viene effettuato senza che il soggetto richiedente abbia ricevuto una appropriata consulenza genetica pre-test, ne abbia compreso le implicazioni ed abbia elaborato un autonomo consenso all esecuzione degli stessi.

2 Consulenza genetica pre e post-test In accordo con lo statuto della European Convention on Human Rights and Biomedicine (Council of Europe, 1997) la consulenza genetica viene effettuata come parte integrante dell intero processo di test genetico. La consulenza pre-test è volta a valutare e a comunicare all individuo e/o ai familiari i meccanismi ereditari della patologia ed il rischio di ricorrenza della stessa in base al grado di parentela con l affetto. Molti pazienti affetti SMA sono in età pediatrica ed ai genitori degli stessi viene offerta la possibilità di un follow-up post-test da parte dell unità di consulenza genetica attraverso l assistenza di uno psicologo. Per i soggetti appartenenti a famiglie SMA, a rischio quindi di essere portatori sani di mutazione, i tests molecolari vengono effettuati solo dopo aver accertato: - la ricezione di una informazione corretta da parte del consultando - la volontà autonoma di procedere all indagine dopo aver valutato le implicazioni personali della stessa - la possibilità di un follow-up post-test per l elaborazione del risultato dello stesso non sempre scontata. Metodiche di indagine molecolare messe a punto nell ambito del progetto Multiplex Real-time PCR Consente di valutare sia lo stato di affetto SMA che lo stato di portatore sano di delezione attraverso valutazione quantitativa dell esone n. 7 del gene SMN1. La messa a punto di questo metodo è stata oggetto di pubblicazione (Passon et. al. 2009) di cui copia è allegata alla presente. Consente le valutazioni di espressione genica di cui ai punti 4 e 5. MLPA Consente di valutare sia lo stato di affetto SMA che lo stato di portatore sano di delezione attraverso una visualizzazione completa e contemporanea di tutti i geni presenti al locus SMA: - numero totali dei geni SMN (1+2) - numero di copie dell esone n. 7 e dell esone n. 8 del gene SMN1 - numero di copie dell esone n. 7 e dell esone n. 8 del gene modulatore SMN2. La metodica MLPA messa a punto nell ambito del progetto è stata oggetto di 2 comunicazioni a congressi (vedi allegati 1 e 2) e argomento di prossima pubblicazione.

3 Incremento del numero di indagini molecolari effettuate Nel periodo sono state effettuate 45 diagnosi di affetto SMA di cui 19 sono risultate positive per delezione di entrambe le copie del gene SMN1. Nello stesso periodo di tempo sono state effettuate 136 analisi molecolari di portatore sano di delezione del gene SMN1. Di queste indagini molecolari, 58 sono state effettuate nel solo anno Quindi, l innovazione tecnologica apportata nell ambito delle problematiche riguardanti la SMA ha consentito un deciso incremento del numero di soggetti analizzati per la condizione di portatore sano di mutazione, a cui poter offrire una risposta diagnostica (vedi istogramma sotto riportato). Inoltre, i tempi di attesa per l utenza si sono grandemente ridotti. VARIAZIONE ANNUALE DELLE ANALISI DI PORTATORI SMA EFFETTUATE SOGGETTI ANALIZZATI ANNI. Tipologia dei soggetti che hanno usufruito delle metodiche innovative messe a punto nell ambito del progetto Dei 136 individui che hanno richiesto di sottoporsi al test molecolare per accertare l eventuale condizione di portatore SMA: 21 sono genitori di soggetti affetti SMA, quindi obbligati portatori di delezione del gene SMN1. Di questi, 19 sono risultati positivi al test molecolare mentre 2 sono risultatì con un genotipo 2/0, ossia con 2 copie del gene SMN1 sullo stesso cromosoma.

4 38 individui non presentano storia familiare per SMA ma sono stati analizzati per la valutazione del rischio riproduttivo in quanto coniugi di appartenenti a famiglie SMA. Uno di questi è risultato portatore di delezione. Se questi 38 individui vengono considerati come appartenenti alla popolazione generale, questo risultato porrebbe la frequenza di portatori sani di delezione in regione pari a 1/38, più alto quindi di quello normalmente attribuito in consulenza genetica alla popolazione generale (1/50 circa). 79 individui presentano una storia familiare per SMA e 25 di questi sono risultati portatori di delezione, di cui 2, di sesso femminile, pur presentando la delezione di entrambe le copie del gene SMN1 risultano asintomatici. Su questa corte di soggetti (familiari di affetti SMA) la frequenza dei portatori sani di delezione risulta quindi pari a circa 1/3. Aggiornamento scientifico e ricerca Oltre all implemento del numero e della qualità diagnostica, Il perfezionamento biotecnologico delle metodiche di indagine molecolare, da noi apportato nell ambito della SMA, ha permesso nel corso del 2008 l identificazione di alcuni genotipi particolari: - due portatori sani di delezione con genotipo 2/0 (2 copie del gene SMN1 sullo stesso cromosoma) genitori di affetti SMA. Questa condizione ha imposto uno studio di segregazione cromosomica nelle due famiglie atto ad identificare o ad escludere la presenza di un tale genotipo nel DNA dei familiari richiedenti il test di portatore. - 2 soggetti di sesso femminile, appartenenti a famiglie SMA che, pur presentando la delezione di entrambe le copie del gene SMN1, risultano asintomatiche. Queste si inquadrano in una minoranza di casi, descritti in letteratura, in cui l assenza completa di copie del gene SMN1 non si accompagna ad un fenotipo patologico (Cobben et al. 1995; Helmken et al. 2003; Prior et al. 2004; drzejowska et al. 2008; Oprea et al. 2008) neppure ad insorgenza tardiva (tipo IV). La particolarità di questi soggetti asintomatici potrebbe essere dovuta o ad un elevato numero di copie del gene SMN2 (Prior et al 2004; drzejowska et al. 2008) (rispettivamente 4 e 5 copie di SMN2 nei soggetti femminili da noi individuati) o ad alti livelli di espressione della

5 Plastina 3, a cui recentemente è stato assegnato un ruolo neuroprotettivo (Oprea et al 2008). L individuazione dei meccanismi molecolari che rendono asintomatici soggetti con delezione in omozigosi del gene SMN1 ha delle importanti ricadute per ciò che è un futuro disegno di interventi terapeutici per gli affetti SMA. In definitiva, da quanto esposto in questa breve relazione, si evince l importanza diagnostica e prognostica, nell ambito della SMA, di un informazione integrata derivante dallo studio contemporaneo di tutti i target molecolari menzionati. Dr. Passon Nadia Responsabile della Neurogenetica Dr. Lonigro Renata Direttore dell Istituto di Genetica Prof. Giuseppe Damante Udine