di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro

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1 di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro

2 Polymerase Chain Reaction Inventata a metà degli anni 80 da Kary Mullis, è a tutt oggi uno strumento di importante impiego nei laboratori biomolecolari Metodo di amplificazione che sfrutta il processo della replicazione del DNA per copiare una specifica regione di DNA

3 Polymerase Chain Reaction: vantaggi 1) Velocità e facilità d uso In poche ore si possono ottenere milioni di copie della sequenza di DNA target 2) Sensibilità Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una singola cellula come template (contaminazione) 3) Robustezza Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di bassa qualità

4 Polymerase Chain Reaction: svantaggi 1) Solo sequenze note Necessario conoscere la sequenza del DNA da a m p l i f i c a r e p e r s i n t e t i z z a r e i p r i m e r s 2) Dimensioni e quantità limitate Dimensioni medie dell amplicone 0.1-5kb Quantità limitata rispetto alle tecniche di clonaggio 3) Proofreading Taq polimerasi manca dell attività 3 5 esonucleasica, 20 cicli di reazione su un frammento di 1 kb produrranno 40% di frammenti con una mutazione puntiforme ( 1/10000)

5 Componenti miscela di reazione: 1. Sequenza DNA target 2. DNA polimerasi termostabile 3. 2 oligonucleotidi specifici per la sequenza 4. dntps 5. Tampone a ph 8 contenente Mg ++

6 Step di ogni ciclo termico 1. Denaturazione del DNA stampo a 95 C 2. Inserimento dei 2 primer (annealing) a CC 3. Estensione (o polimerizzazione),ad opera di Taq polimerasi, dei filamenti complementari a 72 C 4. Ripetere il ciclo per volte

7 Frammento di interesse Denaturazione DNA stampo

8 Annealing Estensione

9 Video PCR

10 Polymerase Chain Reaction: Multiple PCR Cycles 2 copies 4 copies 8 copies DNA fragment to be amplified

11 Cicli Prodotto Cicli Prodotto

12 Polymerase Chain Reaction: resa Resa teorica: 2 n P=(2) n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n) Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza Log[DNA] Esponenziale Lineare Plateau Prodotto variabile N cicli termici

13 Polymerase Chain Reaction: plateau Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede all infinito, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

14 Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di a m p l i f i c a z i o n e è i n f l u e n z a t a minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"

15 RT-PCR quantitativa Rilevamento della fluorescenza associata all amplificazione Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR

16 Termociclatore associato a fluorimetro

17 Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

18 SYBR Green: principio SYBR Green I Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA

19 SYBR Green All inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente

20 SYBR Green Dopo l annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

21 SYBR Green Durante l elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all aumento del numero di copie dell amplicone

22 SYBR green Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa Non-specifica La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la f o r m a z i o n e d i p r o d o t t i a s p e c i f i c i

23 Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare Primer 3 R Q 5 3 Primer La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all interno del frammento amplificato nella reazione di PCR

24 Sonda TaqMan Presenta all estremità 5 un fluoroforo Reporter ed all estremità 3 una molecola Quencher 5 3

25 Reporter-Quencher 5 REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza 3 QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter R Q 5 3 Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q

26 Real-Time PCR: attività 5 >3 esonucleasica R Q 5 R Q R Q 5 3 5

27 L aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati Forward primer Probe Reverse primer

28 Real-Time PCR: applicazioni Quantificazione virale Quantificazione dell espressione genica Efficacia della terapia farmacologica Misura dei danni al DNA Controllo di qualità e validazione dei saggi Detenzione dei patogeni Controllo degli OGM Genotyping MRD

29 MRD (Minimal Residual Disease) Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche Tali elementi neoplastici, presenti ad un livello inferiore alla capacità di rilevazione delle metodiche convenzionali, sono in grado di espandersi e dare origine alla recidiva

30 PCR:per controllare la terapia del cancro Concentrazioni per Southern blotting: 1 cellula su 100 Concentrazioni per PCR: 1 cellula su 1 milione Monitoraggio di diverse forme di tumori linfocitari: mutazioni di RAS cromosoma Ph t(9;22) retinoblastoma del(q14)(13) linfoma follicolare t(14;18)