PCR - Polymerase Chain Reaction

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1 PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA, permette di ottenere in poco tempo notevoli quantità di materiale specifico

2 Science Jan 29;239(4839): Related Articles, Links Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Cetus Corporation, Department of Human Genetics, Emeryville, CA A thermostable DNA polymerase was used in an in vitro DNA amplification procedure, the polymerase chain reaction. The enzyme, isolated from Thermus aquaticus, greatly simplifies the procedure and, by enabling the amplification reaction to be performed at higher temperatures, significantly improves the specificity, yield, sensitivity, and length of products that can be amplified. Single-copy genomic sequences were amplified by a factor of more than 10 million with very high specificity, and DNA segments up to 2000 base pairs were readily amplified. In addition, the method was used to amplify and detect a target DNA molecule present only once in a sample of 10(5) cells.

3 PCR schema

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5 DNA bersaglio Primers Enzima Nucleotidi trifosfati Ioni Mg ++

6 DNA bersaglio Campione Primers Oligonucleotidi sintetici complementari a sequenze fiancheggianti il tratto di DNA da studiare bp Enzima DNA polimerasi Nucleotidi trifosfati

7 Termociclatori Denaturazione del DNA (94 C) Ibridazione dei primers al bersaglio (40 C 60 C) Sintesi del DNA (72 C)

8 RT-PCR Reverse transcription-pcr

9 Vantaggi Si può evitare l uso di tecniche più laboriose. Velocità di esecuzione Si possono analizzare campioni di poche cellule (anche 1 cellula). Elevata sensibilità

10 Biopsie Analisi prenatale e Analisi preimpianto Tracce di infezioni virali Malattia mimima residua Medicina forense

11 End Point PCR Il campione si sottopone al numero di cicli stabiliti (30-40), alla fine della reazione un aliquota si sottopone ad elettroforesi su gel di agorosio per verificare: 1. la lunghezza dell amplificato (controllo del peso molecolare in bp mediante ladder); 2. La quantità di amplificato ottenuto (proporzionale all intensità della banda); 3. L assenza di frammenti aspecifici.

12 La PCR end-point non è un metodo quantitativo Alla fine della reazione non sempre la quantità di DNA del campione d origine è proporzionale all intensità della banda ottenuta. Utilizzando particolari accorgimenti può diventare un metodo semi-quantitativo. Ricerca di mutazioni note; Ricerca di mutazioni non ancora identificate.

13 Log[DNA] Plateau Lineare Esponenzial e Prodotto variabile N cicli termici

14 Polymerase Chain Reaction: plateau Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede all infinito, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

15 Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di a m p l i f i c a z i o n e è i n f l u e n z a t a minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla P C R t r a d i z i o n a l e " e n d p o i n t "

16 Real Time PCR Si utilizzano particolari termociclatori in grado misurare la fluorescenza emessa da particolari fuorofori ad ogni ciclo. La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR

17 Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

18 SYBR Green: principio SYBR Green I Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA

19 SYBR Green Durante l elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all aumento del numero di copie dell amplicone

20 SYBR green Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa Non-specifica La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la f o r m a z i o n e di p r o d o t t i a s p e c i f i c i

21 Curva di dissociazione Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione

22 Curva di dissociazione Tm melting peak

23 TaqMan La Real-Time PCR si può realizzare mediante l impiego: coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano in m a n i e r a a s p e c i f i c a a t u t t o il DNA sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di i n t e r e s s e, m a r c a t e c o n m o l e c o l e f l u o r e s c e n t i Esistono diversi tipi di sonde: Dual-labeled (come le sonde TaqMan) Molecular beacons Scorpion Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

24 Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare Primer 3 R Q 5 3 Primer La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all interno del frammento amplificato nella reazione di PCR

25 Sonda TaqMan Presenta all estremità 5 un fluoroforo Reporter ed all estremità 3 una molecola Quencher 5 3

26 Reporter-Quencher 5 REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza 3 QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter R Q 5 3 Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q

27 Real Time PCR

28 L aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati Forward primer Probe Reverse primer

29 Fluorescenza Curve di amplificazione Plot lineare Cicli di amplificazione Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui C T (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di template iniziale

30 Quantificazione ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i C T Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve) Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro C T con quello del controllo endogeno

31 Quantitativa relativa: analisi dei dati Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente ( C T ) Comparare ciascun C T così ottenuto con il C T di un trattamento di controllo anche detto calibratore (cb) ( C T ) 2 - ( CT,r- CT,cb) = 2 - CT Il valore così ottenuto permette di determinare la c o n c e n t r a z i o n e r e l a t i v a del t a r g e t

32 Valutare le differenze di espressione 2 - CT 2 - CT < 0.3 down regolati 2 - CT > 3 up regolati ln 2 - CT ln 2 - CT < 1 down regolati ln 2 - CT > 1 up regolati

33 Esempio di quantificazione relativa usando il metodo 2 - CT Ct (drn) Old Ct HPRT DELTA Ct old Ct Ct HPRT delta Ct young Delta Delta Ct BRAF 28,1 19,23 8,87 27,18 17,63 9,55 0,68 0, ,47134 NOD1 26,77 19,23 7,54 25,78 17,63 8,15 0,61 0, ,42282 CARD6 29,19 19,23 9,96 29,69 17,63 12,06 2,1 0, ,45561 CARD8 30,67 19,23 11,44 29,12 17,63 11,49 0,05 0, ,03466 CASP1 26,54 19,23 7,31 25,82 17,63 8,19 0,88 0, ,60997 CASP10 29,14 19,23 9,91 28,01 17,63 10,38 0,47 0, ,32578 CASP14 31,06 19,23 11,83 29,6 17,63 11,97 0,14 0, ,09704 CASP2 27,51 19,23 8,28 26,11 17,63 8,48 0,2 0, ,13863 CASP3 27,99 19,23 8,76 26,9 17,63 9,27 0,51 0, ,35351 CASP4 25,84 19,23 6,61 24,39 17,63 6,76 0,15 0, ,10397 CASP5 29,47 19,23 10,24 28,85 17,63 11,22 0,98 0, ,67928 CASP6 25,95 19,23 6,72 24,29 17,63 6,66-0,06 1, , CASP7 28,3 19,23 9,07 26,86 17,63 9,23 0,16 0, ,1109 CASP8 34,12 19,23 14, ,63 11,37-3,52 11, , CASP9 25,28 19,23 6,05 24,32 17,63 6,69 0,64 0, ,44361 CD40 33,28 19,23 14,05 29,3 17,63 11,67-2,38 5, ,64969 CD40LG 28,09 19,23 8, ,63 12,37 3,51 0, ,43295 CFLAR 25,15 19,23 5,92 24,13 17,63 6,5 0,58 0, ,40203 CIDEA 30,9 19,23 11,67 29,56 17,63 11,93 0,26 0, ,18022 CIDEB 30,76 19,23 11,53 29,35 17,63 11,72 0,19 0, ,1317 CRADD 27,43 19,23 8,2 26,09 17,63 8,46 0,26 0, ,18022 DAPK1 31,31 19,23 12,08 29,58 17,63 11,95-0,13 1, , Young potenza ln

34 Real-Time PCR: applicazioni Quantificazione virale Quantificazione dell espressione genica Efficacia della terapia farmacologica Detenzione dei patogeni Controllo degli OGM Genotyping MRD