Metodi di Quantificazione dell Espressione Genica

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1 Metodi di Quantificazione dell Espressione Genica

2 Cosa significa quantificare l espressione genica?

3 Alcune tecniche per quantificare l espressione genica Parte I: RT PCR qrt PCR (Real Time) Parte II: Northern Blot Western Blot

4 RT- PCR mrna + RTasi + oligo- (dt)primer 5 mrna cdna Rnasi H AAAAAAA- 3 TTTTTTTT- 5 RT 3 TTTTTTTT- 5 first - strand cdna Primer TTTTTTTT- 5 5 AAAAAAA- 3 5 Primer 2 PCR Primer 1 3 5

5 Doppo la PCR Corsa ele.rofore0ca Si prepara un gel di agarosio ad una data percentuale (1-2%) con 0,4 µg/ml EJdio Bromuro Si analizzano i risultaj: + Aux - Aux + Aux - Aux MK 10/5 = 2 PIN2 ACT 10/10 = Expr.

6 PCR Semi- quanjtajva Una delle cause della inattendibilità della RT-PCR, a livello quantitativo è la difficolta di stimare esattamente l intensità di segnale di prodotti di amplificazione che vanno a saturazione. La saturazione della reazione di PCR dipende, tra l altro, dalla: Inattivazione della Taq polimerasi Deplezione dei NTP Deplezione dei primers Inibizione da parte del pirofosfato Auto-appaiamento di DNA amplificati Una semplice variante della PCR, nota come PCR semiquantitativa risolve in parte questo problema. Poichè è noto che i primi cicli di amplificazione seguono un andamento ragionevolmente lineare, la PCR semiquantitativa consiste nell effettuare una PCR solo per pochi cicli, di risolvere i prodotti di amplificazione su gel di agarosio e di visualizzare il risultato mediante Southern blotting e ibridizzazione con una sonda radioattiva.

7 PCR compejjva Anche se la PCR semi-quantitativa riesce a dare stime ragionevoli dei livelli di espressione relativi, recuperando, in parte il rapporto tra quantità di messagero e livello di amplificazione, i suoi risultati sono comunque molto approssimati e non può risalire in alcun modo alla concentrazione esatta dei trascritti. La PCR competitiva affronta il problema in modo indiretto: non potendo conoscere la concentrazione esatta del trascritto in esame si preoccupa di compararlo con quella di un mrna o di un DNA a concentrazione nota. In questa tecnica vengono usati due DNA, amplificabili con una stessa coppia di primers, ma risultanti in amplificati di dimensioni diverse. Un DNA, il competitore, è di concentrazione nota. Vengono allestite una serie di reazioni parallele in cui il cdna incognito viene mantenuto costante, mentre il competitore viene aliquotato in diluizioni seriali. La PCR competitiva riesce a stimare la concentrazione di un cdna rispetto alla concentrazione di un DNA competitore, ma non può risalire alla concentrazione del mrna corrispondente, perché non riesce a valutare la variabilità del processo di retrotrascrizione. Quando è possibile avere un mrna competitore di concentrazione nota, si può effettuare una variante di PCR competitiva a partire dalla retro-trascrizione del mrna. I risultati, in questo caso, riescono a stimare meglio la conc. del mrna in esame.

8 1 PCR compejjva Diluizioni seriali di una quantità nota di competitore 2 primer 2 Effettuare la PCR con la stessa coppia di primers competitore (a) primer 1 target (b) primer 2 3 a b primer 1 Analizzare su gel. La coppia con quantità di amplificati approssimativamente uguali indica che il cdna target e il DNA competitore, in competizione per gli stessi primers, all inizio dell amplificazione erano presenti in quantità uguali. Poiché la concentrazione del DNA competitore è nota, si può risalire alla concentrazione del cdna incognito Quantità approssimativamente uguali

9 Real time PCR La PCR in tempo reale è una implementazione della PCR che permette di avere informazioni quantitative più precise sulle concentrazioni relative di cdna amplificati e dei loro mrna corrispondenti. La quantificazione può essere assoluta o relativa. Nel caso della quantificazione assoluta si fa ricorso alla costruzione di una curva di calibrazione standard di RNA a concentrazione nota, da cui si può estrapolare la concentrazione ignota e quindi il numero di copie iniziali del nostro campione. La quantificazione relativa compara, con vari metodi, le concentrazioni relative di due campioni normalizzati ad un gene di riferimento.

10 L accuratezza della qrt-pcr deriva dalla sua capacità di monitorare i prodotti di reazione in tempo reale, che gli permettere di ottenere informazioni sulla fase logaritmica della reazione di PCR Infatti, a differenza della PCR classica che ha bisogno di un post-trattamento, tipicamente un gel di agarosio con bromuro di etidio, per visualizzare i risultati dopo un certo numero di cicli alla fine della reazione, la PCR in tempo reale è in grado di identificare, al suo primo apparire, un prodotto di PCR, monitorando di continuo l andamento della reazione, senza dover interrompere la reazione per poterla visualizzare su gel. La real time PCR risolve questo problema utilizzando precursori fluorescenti, come il bromuro di etidio o il SYBR Green, che vengono incorporati nel prodotto in formazione o che si intercalano nella doppia elica, man mano che si forma. In ogni caso sarà possibile monitorare in tempo reale la formazione del prodotto di amplificazione seguendone l assorbimento con un sistema spettrofotometrico, in un sistema automatizzato che provvede anche alla routine della PCR. In questo modo la qrt-pcr riesce a misurare le curve di accumulo nella loro fase esponenziale

11 Metodo SYBR GREEN e funzionamento della macchina di Real Time PCR SYBR GREEN

12 Metodo Taq Man R Q Sonda TaqMan 3 5 1) Denaturazione Primer for Primer rev ) Appaiamento R Q 3 5 3) Estensione Taq R Q 3 5 4) L a]vità 5-3 esonucleasica della polimerasi degrada la sonda e rilascia il reporter, allontanadolo dal quencher e a]vamdone la fluorescenza R Q 3 3 5

13 CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000,000 AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 1,6E+09 1,4E+09 1,2E+09 1E PCR CYCLE NUMBER 1E+10 1E PCR CYCLE NUMBER

14 La qrt- PCR invece di misurare l accumulo dei prodo] di reazione dopo n cicli, misura i cicli necessari per raggiungere una soglia arbitraria di fluorescenza de`a Ct (concentrajon threshold). Naturalmente il valore di Ct, in questo caso 22, dovrà cadere nella regione esponenziale della curva Ct

15 Trasformando il grafico in scala logaritmica, appare più evidente come il valore di Ct va a cadere nella parte esponenziale della curva logaritmica, assicurando elevata accuratezza a questo Jpo di analisi

16 Un importante proprietà della qrt- PCR è che i valori di Ct sono inversamente proporzionali alla concentrazioni iniziali dei DNA target, come si può verificare facendo diluizioni seriali di un campione e osservando come, man mano che le diluizioni crescono, ci vogliono più cicli per raggiungere la soglia di concentrazione (Ct)

17 Passando in scala logaritmica, come al solito è più evidente la correlazione tra i Ct e le diluizioni (notare che a Ct più eleva0 la correlazione è perduta). series of 10- fold dilujons

18 Metodo di calcolo della real 0me PCR: dai Ct ai ΔCt e alla quan0ficazione Per l'equazione generale della PCR avremo alla concentrazione di treshold (Ct) N f = N i (1+η) ct Dove N f è il numero di copie finali, N i il numero di copie iniziali, η l'efficenza di amplificazione Le concentrazioni di a e b al punto di treshold saranno: N fa = N ia (1+η a ) cta N g = N ib (1+η b ) ctb e poichè, per definizione, N fa = N g abbiamo: N ia (1+η a ) cta = N ib (1+η b ) ctb N ia N ib = (1+η b ) ctb (1+η a ) cta equivalente a: Log N ia Log Ni b = Log (1+η b ) ctb - Log (1+η a ) cta Assumendo η a = η b ; 1+η = E avremo: Log N ia Log Ni b = Log (E)(ctb cta) ct b ct a = Δct

19 Un esempio pra0co di calcolo Se vogliamo conoscere per esempio, la variazione di espressione del gene interleuchina β in seguito a un certo tra`amento, ci calcoliamo la Δct del campione in esame; ct2-ct1 = = Senza considerare l efficienza di amplificazione il trattamento ha indotto il nostro gene: Δct = 2 ct2-ct1 = = = 3104 volte Dobbiamo però considerare l espressione del gene housekeeping di controllo per correggere ct2-ct1 = = 0.13 Il ΔΔct è quindi uguale a: ΔΔct = 2 Δcttarget-Δctcontrollo = = = 2836 volte

20 Calcolo dell'efficienza Finora abbiamo volutamente trascurato l'efficenza di amplificazione (che dipende principalmente dai primers e, in misura minore da parametri sperimentali che possono variare da reazione a reazione), che può in alcuni casi essere molto meno efficiente del 100% A causa della diversa efficienza di amplificazione non è di solito possibile paragonare campioni amplificaj con primers diversi con il metodo del ΔΔct (a meno che non abbiano la stessa efficenza) Graficando in ordinata i Ct e in ascissa il log delle concentrazioni, tu] i punj cadono lungo una re`a con un alto valore di correlazione. E quindi possibile costruire una curva di taratura da cui estrapolare l'efficenza di amplificazione

21 Calcolo dell'efficienza Per l'equazione generale della PCR avremo al punto Ct: N f = N i (1+η) ct trasformiamando in Log: Log N f = Log N i + ct Log (1+η) e risolvendo per ct: ct = - (1/Log (1+η)) Log N i + Log N f o`eniamo l'equazione di una re`a dove: ct = y - 1/Log (1+η) = m Log N i = x Log N f = q da cui possiamo ricavare η come: η = [10 (- 1/m) ] - 1

22 Un uljmo problema da risolvere prodo] non specifici Su gel di agarosio eravamo in grado di disjnguere, in base al peso molecolare, la presenza di uno o più prodo] non specifici INVECE Mk Prodo`o specifico Prodo] non specifici La macchina di Real Time misura l intensità di fluorescenza riemessa dal pozze`o senza disjnguere la provenienza del segnale La curva di dissociazione risolve il problema

23 Un esempio prajco La curva di dissociazione: Gene A Gene B Contaminazione

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