Scientists with lab coats: Corso di laboratorio Chimico-Biologico. Dott.ssa Valeria Berton Università di Verona

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1 Scientists with lab coats: Corso di laboratorio Chimico-Biologico Dott.ssa Valeria Berton Università di Verona

2 Come «vedere» il DNA: la PCR PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi) da 1 filamento di DNA miliardi di copie in poche ore Necessari: Campione di DNA 2 primers (sequenze complementari alla regione che vogliamo amplificare, 1 primer/filamento) DNA polimerasi Nucleotidi (A, T, C, G) Buffer Acqua Termociclatore

3 Campione di DNA Campione di tessuto / sangue Isolare il DNA (ed eliminare il resto) Prelevare una piccola quantità di tessuto / sangue (0,1 0,5 gr) e metterlo in una vial Aggiungere lo stesso volume di Buffer di Lisi EDTA Tris ph 7.5 1% SDS RNAsi Chelante, sequestra gli ioni ed evita l attivazione delle DNAsi Sali per regolare acidità e osmolarità (variazioni di ph i DNA perde la sua forma a doppio filamento) Detergente per rompere le membrane cellulari Per ottenere DNA puro Distruggere (gentilmente) il tessuto con un mini-pestello Attenzione, non deve essere troppo viscoso! Aggiungere Buffer di lisi se necessario Centrifugare ( rpm) per separare le componenti cellulari dal DNA Prelevare il surnatante e aggiungere fenolo/cloroformio 1:1 Purifica il DNA dalle proteine cellulari

4 Campione di DNA Mescolare Centrifugare Prelevare i surnatante e aggiungere isopropanolo Mescolare Centrifugare Prelevare il surnatante e conservare il pellet Lavare il pellet con etanolo 70-75% Centrifugare Prelevare il surnatante Lasciare asciugare il pellet Risospendere il pellet in H 2 O distillata o TE (con EDTA)

5 Controllo il DNA: spettrofotometro Purezza Concentrazione Spettrofotometro: misura la radiazione assorbita da una materia (che è proporzionale alla massa della materia stessa) I 0 : intensità iniziale I 1 : intensità finale I 1 /I 0 = Trasmittanza Assorbanza: A = ελ l M Molarità (concentrazione) Costante per ogni sostanza

6 assorbanza Controllo il DNA: spettrofotometro Grafico assorbanza del DNA puro 1,6 50 μg DNA / ml = 1 u.a. 260 Conc. μg DNA / ml = A 260 x 50 / 1 u.a. 5 μl di DNA 1000 μl Diluizione: lunghezza d onda (nm) A 260 = 0,5 50 μg : 1 = x μg : 0,5 x μg = 0,5 x 50 / 1 Diluizione DNA? 25 x 200 = μg DNA /ml

7 Controllo il DNA: spettrofotometro DNA e proteine hanno un picco di assorbanza a lunghezze d onda diverse 260/280: contaminazione da proteine 260/230: DNA contaminato da EDTA, fenolo

8 Controllo il DNA: elettroforesi e gel di agarosio Valutazione approssimativa di: concentrazione, lunghezza e purezza del DNA Il DNA in soluzione viene messo in un gel e viene sottoposto ad un campo elettrico I gruppi fosfato dello scheletro del DNA sono carichi negativamente In un campo elettrico il DNA migra verso il polo positivo

9 Controllo il DNA: elettroforesi e gel di agarosio La polvere di agarosio viene sciolta in una soluzione tampone calda; si aggiunge un colorante fluorescente La soluzione calda viene versata su un apposito supporto con un pettine Man mano che la soluzione si solidifica, l agarosio forma delle maglie Più agarosio nella soluzione maglie più strette molecole lunghe di DNA non riusciranno ad attraversare le maglie Meno agarosio nella soluzione maglie più larghe molecole lunghe di DNA passano più facilmente La quantità (la percentuale) di agarosio nella soluzione va determinata per campioni di dimensioni diverse

10 Controllo il DNA: elettroforesi e gel di agarosio Quando il gel è solidificato, si mette nella vasca elettroforetica Si toglie il pettine rimangono dei fori nel gel Preparazione del campione di DNA: un aliquota di DNA viene miscelata con - saccarosio/glicerolo (per renderlo più denso) - un colorante (per renderlo visibile)

11 Controllo il DNA: elettroforesi e gel di agarosio Metto il campione di DNA in un pozzetto (e altri campioni negli altri) Applico corrente elettrica Attenzione all orientamento del gel! Posso seguire la corsa del gel grazie al colorante aggiunto Il colorante fluorescente presente nel gel si lega al DNA

12 Controllo il DNA: elettroforesi e gel di agarosio Posiziono il gel sopra ad un transilluminatore il colorante viene eccitato emette fluorescenza DNA marker: riferimento del peso DNA integro: unica banda, molto alta DNA frammentato: «smear», striscio di bande

13 Come «vedere» il DNA: la PCR PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi) da 1 filamento di DNA miliardi di copie in poche ore Necessari: Campione di DNA 2 primers (sequenze complementari alla regione che vogliamo amplificare, 1 primer/filamento) DNA polimerasi Nucleotidi (A, T, C, G) Buffer Acqua Termociclatore

14 PCR: primers Devono essere specifici Lunghezza del primer: se corto meno specifico se lungo più specifico, ma devono essere più puri bp Composizione: no ripetizioni interne, no omologie (AAATTTAAATTT) primer ricchi di GC possono sostenere Temp di annealing più alte Corrispondenza con la sequenza target: deve essere massima tollerati mismatch, ma non al 3 C o G in 3 per favorire legame Se la sequenza target è ignota? Si confrontano sequenze omologhe per trovare le regioni più conservate (uguali in specie diverse)

15 PCR: primers Software: Primer Premier AlleleID Beacon Designer PrimerPlex Vector NTI Advance software Primer BLAST

16 Come «vedere» il DNA: la PCR PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi) da 1 filamento di DNA miliardi di copie in poche ore Necessari: Campione di DNA 2 primers DNA polimerasi Nucleotidi (A, T, C, G) Buffer Acqua Termociclatore

17 PCR: Polimerasi Taq polimerasi Thermus aquaticus Temp ottimale C (1000 bp in meno di 10 sec a 72 C) Emivita: 2 ore a 92.5 C Non ha attività di proofreading (Pfu DNA polimerasi) Utilizza ioni Mg++ come catalizzatori La concentrazione di MgCl 2 nella reazione è fondamentale Basse concentrazioni polimerasi meno attiva ma più specifica Alte concentrazioni polimerasi più attiva ma meno specifica

18 Come «vedere» il DNA: la PCR PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi) da 1 filamento di DNA miliardi di copie in poche ore Necessari: Campione di DNA 2 primers DNA polimerasi Nucleotidi (A, T, C, G) Buffer Acqua Termociclatore

19 Nucleotidi dntps (deossinucleotidi) datp dctp dgtp dttp Aggiungere alla soluzione

20 Come «vedere» il DNA: la PCR PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi) da 1 filamento di DNA miliardi di copie in poche ore Necessari: Campione di DNA 2 primers DNA polimerasi Nucleotidi (A, T, C, G) Buffer Acqua Termociclatore

21 Buffer 10-50mM Tris-HCl ph 8.3, fino a 50mM KCl, 1.5mM o più di MgCl 2 stabilizza il DNA durante l amplificazione ma può diminuire la denaturazione cofattore della polimerasi; ma influenza la specificità dell appaiamento

22 Come «vedere» il DNA: la PCR PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi) da 1 filamento di DNA miliardi di copie in poche ore Necessari: Campione di DNA 2 primers DNA polimerasi Nucleotidi (A, T, C, G) Buffer Acqua Termociclatore

23 PCR Denaturazione Annealing (appaiamento dei primers) Amplificazione Denaturazione: equilibrio tra riuscire a denaturare (separare) il DNA e non denaturare la Polimerasi Annealing: i primer devono legarsi al DNA Temp troppo alta denatura il DNA i primer non si legano Temp troppo bassa i primer si legano a sequenze non specifiche La Temp alla quale il 50% dei primer si lega: AT = 2 C; CG = 4 C Amplificazione: Temp ottimale per la Polimerasi (72-75 C)

24 PCR 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo

25 Elettroforesi Posiziono il gel sopra ad un transilluminatore il colorante viene eccitato emette fluorescenza DNA non amplificato: unica banda, molto alta Se conosco il peso del frammento amplificato con PCR: Controllo la presenza di una banda all altezza del peso corretto

26 Non vedo la banda corrispondente Riprova (magari sbagliato un passaggio) DNA ladder 1 2 Diminuire la Temp di annealing (anche solo nei primi cicli) Controllare la sequenza dei primer Controllare la concentrazione dei primer (troppo bassa) Aumentare il numero dei cicli Il campione di DNA era troppo poco Il campione di DNA era contaminato da impurità (durante l estrazione) La polimerasi non ha funzionato (controllare il buffer) Se c è la banda del controllo positivo e non del campione, potrebbe esserci un interferenza da parte di qualche sostanza presente nel campione

27 Smear / Bande multiple Meno DNA campione Aumentare la Temp di annealing (legame più specifico) Controllare la sequenza e la lunghezza dei primer Controllare la concentrazione dei primer (troppo alta) Contaminazione con DNA esogeno (strumentazione, area di lavoro, operatore) Banda nel controllo negativo Cambiare tutte le soluzioni Pulire la strumentazione Lavorare in modo più attento

28 PCR Molti componenti della PCR sono volatili e molto concentrati Aliquote, conservazione a -20 C Contaminazione della strumentazione Set di strumenti diversi per ogni fase: preparazione delle mix, utilizzo post-pcr, caricamento del gel Controlli! Positivo: DNA che abbiamo visto funziona bene con i primers che sto per usare Negativo: stessa preparazione dei campioni, ma non contiene DNA