Dott.ssa Quintarelli Concetta

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1 Dott.ssa Quintarelli Concetta

2 Estrazione e quantizzazione degli acidi nucleici Pre-PCR Accetazione Post-PCR Refertazione

3 Area PCR GUANTI MONOUSO PUNTALI CON FILTRO CESTELLO PER GHIACCIO TUBINI PCR

4 Materiale di laboratorio per eseguire la PCR Pipette Puntali con filtro Provette Porta-provette Cestello del ghiaccio guanti

5 Puntali con filtro P10: fino a 10 l P20: fino a 20 l P100: fino a 100 l P200: fino a 200 l P1000: fino a 1000 l

6 Pipette P2: da 0,2 a 2 l P10: da 1 a 10 l P20: da 2 a 20 l P100: da 20 a 100 l P200: da 50 a 200 l P1000: da 200 a 1000 l

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8 Provette 500 l 1,5 ml 2 ml 200 l

9 Reazione di Polimerizzazione a Catena 1: Denaturazione 3: Polimerizzazione 2: Annealing Primer 2 n

10 2 funzioni principali Analitica Consiste nell identificazione della presenza/assenza di determinate sequenze geniche nel campione in esame Preparativa Il campione amplificato serve come bersaglio per l applicazione di ulteriori tecniche di biologia molecolare Taglio con enzimi di restrizione Ibridazione Sequenziamento diretto Analisi quantitativa

11 Screening di mutazioni Note Sconosciute analisi con enzimi di restrizione PCR-real time ARMS reverse dot-blot sequenziamento D-HPLC Microarray

12 Il DNA bersaglio Un gene (o tratti di esso) correlato a malattie genetiche ereditarie o neoplasie Tratti di DNA polimorfici che possono essere utili per caratterizzare un individuo DNA o RNA esogeno appartenente ad un microorganismo che codifica per funzioni vitali essenziali o per fattori di virulenza Il bersaglio da amplificare può anche essere una molecola di RNA (ad es., alcuni virus) che deve essere sottoposta ad una reazione di RT-PCR

13 RT-PCR Estrazione di mrna Sintesi del cdna utilizzando trascrittasi inversa (priming possibile con oligo-dt, oligo random o primer specifico) Amplificazione con oligonucleotidi specifici Elettroforesi su gel di agarosio

14 Caratteristiche dell RT-PCR E in assoluto la tecnica più sensibile, in quanto utilizza la PCR. Non richiede purificazione dell mrna Richiede pochissimo RNA di partenza (si può partire da qualche decina di cellule) Semplice e rapida Funziona anche su RNA parzialmente degradato Non da informazioni sul peso molecolare dell mrna Non è quantitativa a meno di non usare particolari accorgimenti

15 Allestimento della reazione di PCR Quando si allestisce la reazione di PCR è bene porre i componenti nella provetta nel seguente ordine: Fase 1) Preparazione della mix Acqua deionizzata ed autoclavata buffer, MgCl 2, dntp, primer Taq polimerasi Fase 2) Aggiunta del campione di DNA N.B. E assolutamente necessario porre tutti i reagenti in ghiaccio! CESTELLO PER GHIACCIO

16 Fase 1) preparazione della mix MgCl 2 Una DNA polimerasi termostabile aumenta la specificità della reazione favorendo l appaiamento dei primer, la funzione della Taq polimerasi I quattro deossiribonucleotidi trifosfato datp o 2 -Deossiadenosina-5 -Trifosfato dgtp o 2 -Deossiguanosina-5 -Trifosfato dctp o 2 -Deossicitidina-5 -Trifosfato dttp o 2 Deossitimidina-5 -Trifosfato Una coppia di primer o inneschi oligonucleotidici di sintesi (~20 nucleotidi) complementari alle regioni fiancheggianti la sequenza DNA target

17 PRIMER Sono prodotti in vitro per sintesi chimica ed hanno una lunghezza compresa fra 15 e 30 nucleotidi. Primer più lunghi forniranno maggiore specificità La tipologia di primer varia a seconda dello scopo della PCR Malattie genetiche ereditarie: a) primer complementari alle regioni adiacenti a quella in cui si trova la mutazione da individuare; b) primer in cui uno dei due sia complementare alla sequenza mutata. Quindi, in assenza della mutazione non si avrà alcun prodotto PCR. Malattie infettive: si usano primer specie-specifici o che permettono di distinguere tra ceppi patogeni e non.

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19 La sequenza da amplificare ( target ) è contenuta tra due regioni, di cui è nota la sequenza nucleotidica, dette regioni fiancheggianti. ACTGGCTAAGAGGATGCTGACTTGGCCATCTACGGCCTACG TGACCGATTCTCCTA ACTGGCTAAGAGGATGCTGACTTGGCCATCTACGGCCTACG GTAGATGCCGGATGC

20 SCELTA DEI PRIMER L obiettivo della PCR è di amplificare una specifica sequenza target senza contemporaneamente amplificare altre sequenze con formazione di prodotti aspecifici! L errata scelta dei primer può dare origine a: Scarsa o mancata sintesi della sequenza target (no amplificati) Sintesi di prodotti di amplificazione aspecifici Formazione di dimeri di primer

21 E necessario che le estremità della sequenza da amplificare siano conosciute con sufficiente precisione per poter sintetizzare degli oligonucleotidi Genbank

22 1. Go to Genbank, look up sequence of virus or organism of interest

23 2. Info about: - publishers of sequence-when and who - organism - source of material

24 3. Info about translation, capping, DNA sequence

25 La temperatura di fusione (melting, Tm) è una temperatura alla quale metà delle sequenze complementari sono ibridate dipende dal grado di omologia esistente fra le due sequenze ibridate Tm dei primer = 4(G+C) + 2(A+T)

26 Dalla Tm alla Ta. Tm dei primer = 4(G+C) + 2(A+T) Ta = La media delle Tm dei due primer 4 C Primer F: gacttagaatcgtacgagat Primer R: cattgcatatgcacagtgtat Tm Primer F = 4(5+3) + 2(7+5) = 56 C Tm Primer R = 4(4+4) + 2(6+7) = 58 C Media di Tm Primer F+Tm Primer R = 57 C Ta = 57-4 = 53

27 La concentrazione dei primer nella mix per la reazione di PCR varia da 0,1 a 1 M Un eccesso di primer nella PCR mix provoca: formazione di prodotti di amplificazione aspecifici, riducendo la quantità di amplificato finale appaiamento dei primer tra di loro (dimeri) e non dei primer al tratto di DNA da amplificare, riducendo l efficienza di amplificazione Per allestire una PCR è necessario ottimizzazione la concentrazione dei primer tramite diluizioni scalari.

28 CAPRI (Common Application Program Remote Interface) È un interface web che permette di accedere ai maggiori strumenti bioinformatici del momento. È stato creato per garantire un facile accesso ai ricercatori che utilizzano strumenti bioinformatici (disegno di primer, analisi di sequenze, ad es. BLAST)

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31 1. Lunghezza compresa fra 18 e 30 basi (influenza la specificità, la Tm ed il tempo di annealing) 2. Contenuto in GC del 40-60% 3. Distribuzione uniforme dei nucleotidi C e G nel primer 4. Non più di 3 nucleotidi C o G all estremità 3' dei primer (aumenta la possibilità che i primer formino dimeri) 5. No sequenze fra loro complementari nei due primer della coppia (dimeri) 6. No sequenze complementari nello stesso primer (loop) 7. Tm dei due primer simile, T m1 ~T m2 (differenza al max di 5 C altrimenti amplificazione meno efficiente). 8. No regioni complementari al primer (mispriming areas) o a parti di esso all interno della sequenza target 9. No cross-homology con sequenze ripetute (omologhe) in altri loci del DNA genomico (mispriming e sintesi di aspecifici). Controllare con BLAST!

32 TTCGTTTGGAAAGTGGGGGTGTTTCCTATGTAAATATTTTTGG CTTTGTTGCGTTAGGTTTTCCCTTTGGCCTGCGTTAGTTCCAG TGACTGTCTCCGAGAATGATGTAAACCTGACCCACATTGAAT CTAGACCTTCTCGTTTAAAGAAAGATGAGTATGAATTTTTCAC CCATTTGGATAAACGTAGCCTGCCTGCTCTGACAAACATCAT CAAGATCTTGAGGCATGACATTGGTGCCTGGTATATTTTAGA CATATAGTACTGTCCATGAGCTTTCACGAGATAAGAAGAAAGA CACAGGTAAGAATTAGAGGAATTTTGCAAATAACAGCA Primer Possibili Coppia I Coppia II Coppia III Fw: TTTGTTGCGTTAGGTTTTCC Rev: TCGTGAAAGCTCATGGACAGT Fw: TTTGTTGCGTTAGGTTTTCC Rev: GCTTAACGCAATGTACCTG Fw: GTGACTGTAGTTCCATCGTC Rev: ATTGGCTGACCTGTGGACAGT

33 Valutazione della purezza del primer

34 MgCl 2 da 0,5 a 2,5 mm Una concentrazione ottimale è necessaria: per l'attività della polimerasi, per il corretto appaiamento dei primer per la specificità del prodotto di PCR, poichè aumenta la temperatura cui il DNA stampo si denatura Effetti della concentrazione scalare di MgCl 2 nella mix di reazione PCR. Una concentrazione troppo elevata altera l appaiamento dei primer al tratto di DNA target

35 dntps da 20 a 200 M Sono i mattoni necessari per costruire i nuovi filamenti di DNA datp o 2 -Deossiadenosina-5 -Trifosfato dgtp o 2 -Deossiguanosina-5 -Trifosfato dil. 1:4 100 mm dctp o 2 -Deossicitidina-5 -Trifosfato dttp o 2 Deossitimidina-5 -Trifosfato Nella mix di reazione si aggiunge una miscela equimolare dei 4 nucleotidi trifosfati. 2,5 M La concentrazione ottimale varia in base alla composizione del tratto specifico da amplificare e quindi va determinata sperimentalmente. Concentrazioni troppo alte inibiscono l attività della Taq polimerasi.

36 Taq DNA Polimerasi Thermus aquaticus (Taq polymerase) è omologo della DNA polymerasi I (Pol I) di Escherichia coli e presenta domini responsabili dell attività 5 nucleasica. Enzima termostabile isolato da uno strain di E. coli trasfettato con il gene Taq DNA polymerase. Enzima ad attività Terminal transferasica che risulta nell addizione di un singolo nucleotide (adenosina) al 3" del prodotto esteso. Taq DNA Polimerasi è l enzima più comune usato per: - PCR - 3"A-tailing di filamenti blunt. - Primer extension - DNA sequencing.

37 Taq Polimerasi da 0,25 a 2 Unità consente l'uso di T di annealing e di allungamento elevate (reazione stringente) presenta un picco d'attività enzimatica attorno ai C permette di amplificare frammenti di lunghezza superiore alle 400 bp (fino ad un massimo di 10 Kb) a differenza d'altre polimerasi, presenta un'attività esonucleasica 5'-3' ma non in direzione 3'-5'.

38 L AmpliTaq DNA Polimerasi è una DNA Polimerasi di 94 kda ultra-pura, gelatin-free, termostabile, ricombinante che si ottiene dall espressione di una forma modificata del gene della DNA polymerase in E. coli. la natura ricombinante e la purificazione rendono questo enzima puro e con attività riproducibile da provetta a provetta e da lotto a lotto. Il suo profilo di attività termica lo rende ideale per le applicazioni di PCR poichè la sua attività ottimale è allo stesso range della temperatura di appaiamento dei primer, cioè 55 C 75 C. L emivita dell enzima è ~40 minuti a 95 C

39 SM SM Concentrazioni elevate di enzima non provocano un aumento del prodotto di amplificazione

40 Limiti della Taq Polimerasi Convenzionale La Taq Polimerasi è attiva anche a temperatura ambiente o in ghiaccio. Quando tutti i componenti sono stati posti nella reazione, annealing aspecifico dei primer potrebbe favorire amplificazione non desiderata: produzione di prodotti non specifici riduzione della resa.

41 HotStarTaq DNA Polymerase È una forma chimicamente modificata dell Amplitaq DNA polymerase. -Anticorpi neutralizzanti -Modifiche chimiche (Taq-Gold; Taq-Platinum) Agenti bloccanti la Taq sono inattivati solo durante il primo ciclo a C.

42 Reazione di polimerizzazione mediante uso di HotStarTaq

43 A: AmpiTaq DNA polymerase G: AmpiTaq Gold DNA polymerase M: Size Marker

44 Fase 2) Aggiunta del DNA target sequenza di DNA bersaglio

45 DNA da 50 a 250 ng Concentrazioni elevate di DNA inibiscono drammaticamente l attività della Taq polimerasi.

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48 Veriti Thermal Cycler

49 Caratteristiche principali La presenza del touch screen rende questo termociclatore di semplice utilizzo È possibile utilizzare fino a 6 diverse temperature di annealing

50 1: annealing temperature being set for six different primers. 2: VeriFlex Blocks: Six individual Peltier blocks. 3: PCR results showing six primer sets run

51 Informazioni importanti!!! - Evitare contaminazioni da amplificati di DNA, attraverso l'adozione di pratiche laboratoristiche rigorose. -Separazione rigorosa dei reagenti pre e post amplificazione; - Linee guida specifiche per il campione manipolato; - il personale laboratoristico dovrebbe essere costantemente cosciente delle fonti di contaminazione possibili: -carry-over da campione a campione -contaminazione dei campioni durante l aliquotazione e la distribuzione -presenza di sequenze bersaglio clonate nei laboratori che hanno isolato e caratterizzato le stesse sequenze che ricercano. UTILIZZARE SEMPRE reazioni di controllo negative per ognuno dei passaggi principali nel trattamento dei campioni.

52 Soggetti con malattia CONTAMINAZIONI La PCR è una tecnica molto sensibile Pertanto, è facilmente soggetta a contaminazioni da parte di molecole di DNA genomico provenienti da fonti diverse da quelle di interesse (es. prodotti di amplificazione di precedenti PCR presenti in lab.) Falsi Negativi Veri Positivi Falsi positivi Test + Test - Malati Veri Positivi Falsi Negativi Non malati Falsi Positivi Veri Negativi

53 PREVENIRE LE CONTAMINAZIONI Locali separati per estrazione, conservazione degli acidi nucleici e preparazione PCR Guanti monouso Materiale dedicato solo a PCR Preparazione della PCR eseguita sotto cappa a flusso laminare Decontaminazione periodica delle pipette automatiche con radiazioni UV Pipette differenti opportunamente siglate (fase pre-pcr e post-pcr) Punte dotate di filtro Acqua deionizzata ed autoclavata

54 Controllo di qualità in PCR Controllo negativo per evidenziare risultati falsi positivi (costituito da tutti i componenti della PCR mix eccetto il DNA) Controllo positivo per verificare la funzionalità di tutti i reagenti (es., diluizione scalari in grado di dare un risultato positivo)