Tecniche di sequenziamento del DNA

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1 Tecniche di sequenziamento del DNA -Metodo di Maxam e Gilbert (della degradazione chimica del DNA) -Metodo di Sanger (a terminazione di catena)

2 Metodo di Maxam-Gilbert Questo metodo, basato sulla degradazione chimica del frammento di DNA da sequenziare, è ormai poco utilizzato perché utilizza composti chimici dannosi alla salute. Si differenzia dal metodo di Sanger perché non utilizza sintesi enzimatica ma trattamenti chimici che agiscono a livello di singoli nucleotidi. E basato sull abilità di alcuni composti chimici, quali l idrazina, e il dimetilsolfato (DMS) di modificare in modo specifico le basi all interno del DNA, rispettivamente le pirimidine e le purine, e della piperidina di catalizzare la rottura del filamento del DNA a livello dei nucleotidi modificati.

3 Metodo Maxam-Gilbert 1. Marcatura terminale con 32 P al 5 o al 3 del DNA a doppio filamento 2. Denaturazione e separazione dei due filamenti di DNA 3. Il DNA marcato a singola elica viene suddiviso in quattro aliquote, ognuna delle quali viene sottoposta a trattamento con DMS o idrazina, in presenza di piperidina. 1. DMS + piperidina = rottura in corrispondenza della G 2. DMS + piperidina in acido formico = rottura in corrispondenza di G e A 3. idrazina + piperidina = rottura in corrispondenza di C e T 4. idrazina + piperidina in NaCl 1,5 M = rottura in corrispondenza della C Le reazioni sono condotte in modo controllato in modo tale che in ogni reazione ogni filamento marcato sia tagliato una sola volta: statisticamente tutti le basi saranno degradate producendo una serie di frammenti la cui lunghezza dipenderà dalla distanza tra l estremità marcata e il sito di taglio 4. Separazione dei filamenti marcati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide 5. Visualizzazione mediante autoradiografia, come bande radioattive corrispondenti a ciascun nucleotide presente nel frammento originale.

4 Metodo di Maxam-Gilbert G G+A T+C C

5 Metodo di Sanger (o metodo a terminazione di catena) Dideossinucleotidi trifosfati (ddntp) o Terminatori di catena

6 Metodo di Sanger Il metodo di Sanger originale consisteva nella sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento, in presenza di ddntp. Lo stampo di DNA a singolo filamento è ottenibile mediante: -il clonaggio del frammento da sequenziare in un vettore derivante dal fago M13 -il clonaggio del frammento da sequenziare in un vettore plasmidico, poi convertito a singolo filamento mediante trattamento con alcali o denaturazione termica La sintesi del DNA richiede : -un innesco specifico (primer) complementare al filamento da sequenziare -la DNA polimerasi -una miscela dei 4 dntp+ 1 ddntp, una per ogni reazione di sequenza -la marcatura dei filamenti di nuova sintesi con un dntp marcato (con 35 S, 32 P)

7 La reazione di sequenza era suddivisa in provette di sintesi, ciascuna delle quali conteneva il DNA stampo, il primer, la DNA polimerasi e la miscela dei 4 dntp (di cui uno radioattivo) e un ddntp (a concentrazione 1:100 rispetto al corrispondente dntp). Al termine della reazione, ogni miscela contiene una popolazione di filamenti di nuova sintesi, che hanno in comune l estremità 5 ma che differiscono in lunghezza perché la loro sintesi è stata bloccata in diverse posizioni al 3. I filamenti marcati sono separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide-urea (5-7M) ad elevato voltaggio.

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9 Le DNA polimerasi per il sequenziamento devono essere caratterizzate da: Elevata processività attività esonucleasica 3-5 trascurabile attività esonucleasica 5-3 trascurabile 1. Klenow DNA polimerasi priva dell attività esonucleasica DNA polimerasi del fago T7 (Sequenase) 3. Taq DNA polimerasi sequenziamento a ciclo termico

10 Sequenziamento a ciclo termico I Frammenti di Sanger sono prodotti mediante amplificazione lineare di una piccola quantità di DNA stampo, utilizzando i cicli termici della PCR Vantaggi: -Utilizza DNA a doppio filamento piuttosto che a singolo filamento -non necessita del clonaggio del DNA da sequenziare, perché richiede una quantità molto piccola di DNA stampo -la reazione è condotta ad alta temperatura (65-70 C), che minimizza artefatti che possono essere prodotti da eventuali strutture secondarie nel DNA.

11 Sequenziamento a ciclo termico DNA stampo PCR con un solo primer Taq DNA polimerasi+ 4 dntp+1 ddntp (100:1) Reazione A (ddatp) denaturazione, appaiamento, elongazione dda dda dda dda Vengono allestite 4 reazioni di PCR, ognuna contenente un primer e la miscela dntp/ddntp e la Taq DNA pol. In questo modo si ottiene soltanto il filamento complementare allo stampo. Per ogni reazione si genera una miscela di filamenti a catena terminata che sono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide

12 Marcatura dei frammenti di Sanger con fluorocromi Sequenziamento automatico

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14 Fluorocromi (BigDye TM ) (Emissione Variabile) (Assorbimento a 490nm)

15 BigDyes for Dye Terminator and Dye Primer Sequencing H2N Cl NH (dr110/fam) H N N (dr6g/fam) Cl C2- C2- Cl H HN -2C HN Cl H -2C N H C DNA N H C DNA A max 490 nm E max 540 nm A max 490 nm E max 565 nm Me2N Cl C2- NMe2+ (dtamra/fam) N + N (drox/fam) Cl C2- Cl H HN -2C HN Cl H -2C N H N H C DNA C DNA A max 490 nm E max 590 nm A max 490 nm E max 615 nm I quattro fluorocromi hanno differenti proprietà di emissione In funzione della natura dei gruppi R.

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17 Due modalità di marcatura fluorescente dei frammenti di Sanger Marcatura dei primer BigDye Primers Marcatura dei ddntp BigDye Terminators

18 Dye Primers Labelling Enzyme, dntp & ddntp A A ACCGTA C A C AC C G ACC G T ACCG T ACCGTA T Annealing Extension Products

19 Dye Primers Labelling Al termine della reazione è possibile unire le quattro reazioni di sequenziamento e separare i prodotti su una singola corsia di un gel

20 Dye Terminators Labelling DNA Polymerase, dntp s and DyeDeoxyterminators A C G T A A C AC C ACC G ACCG T ACCGTA ACCGTA T Annealing Extension Products Coniugando a ciascun ddntp un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare la reazione di sequenza in un unico tubo e separare i prodotti su una singola corsia di un gel

21 Dye Terminator Labelling

22 L intensità e la lunghezza d onda delle emissioni fluorescenti vengono captate durante l elettroforesi quando i frammenti di DNA, eccitati dalla luce laser, passano davanti ad un rilevatore.

23 Elettroferogramma La sequenza di DNA è determinata da un software in grado di interpretare le misure di fluorescenza registrate dal rilevatore e di elaborarle opportunamente. Le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all intensità di emissione.

24 Sequenziatori automatici -elettroforesi su gel di poliacrilamide -elettroforesi capillare

25 Sequenziatori a gel gel di poliacrilammide (dal 4% al 6%) molto sottili in condizioni denaturanti (Urea) Apparati verticali di lunghezza variabile a seconda del numero di basi da leggere (22 cm-1 m) Esistono kits in commercio che permettono di velocizzare e standardizzare tali operazioni fornendo soluzioni di poliacrilammide a cui aggiungere soltanto Temed o gel preformati

26 Sistema di elettroforesi capillare BI PRISM 3100 Genetic Analyser La separazione elettroforetica dei frammenti fluorescenti avviene in un capillare del diametro di 50 µm contenente un polimero di corsa il sistema carica automaticamente il capillare con il polimero di corsa i frammenti marcati di DNA vengono rilevati man mano che correndo lungo il capillare, raggiungono la detection window Introduction 3100 Training 1 Capillare 16 Capillari 96 Capillari

27 Capillary array comprises: 16 capillaries- allows electrokinetic injection of 16 samples simultaneously Direct Injection from Microtiter Plates

28 Capillary Array:Detection Cell

29 Detection Cell Laser CCD Camera

30 Electrokinetic Injection Capillary and electrode are placed into the sample Voltage is applied - charged DNA enters the capillary and it migrates toward the + electrode at the other end of the capillary

31 Nuovi metodi di sequenziamento Pirosequenziamento

32 Pirosequenziamento Si basa sulla rilevazione del pirofosfato rilasciato dall incorporazione di un nucleotide durante la sintesi del DNA polymerase (DNA) n + dntp (DNA) n+1 + PPi ATP sulfurylase+ APS PPi ATP luciferase ATP+ luciferin + 2 light+amp+ppi+oxyluciferin+c2

33 Pirosequenziamento C + DNA polimerasi, apyrase + ATP sulfurylase + luciferase apyrase

34 Il Pirosequenziamento (Ronaghi M, Ehleen M and Nyrén P (1998) A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science, 238, ). Il primer è ibridato allo stampo a singolo elica, e incubato con gli enzimi DNA polimerasi, ATP sulfurilasi, luciferasi e apirasi, adenosin 5 fosfosolfato (APS) e luciferasi. Il primo dei quattro dntp viene aggiunto alla reazione. La DNA polimerasi catalizza l incorporazione del dntp al filamento di DNA, se è complementare alla base del filamento stampo. gni evento di incorporazione è accompagnato dal rilascio di piro-fosfato (PPi) in quantità equimolare a quella del nucleotide incorporato. In presenza di adenosina 5 fosfosolfato (APS), l ATP sulforilasi converte quantitativamente il PPi ad ATP, che, a sua volta guida la conversione, catalizzata dalla luciferasi, di luciferina ad ossiluciferina con conseguente produzione di luce di intensità proporzionale alla quantità di ATP. La luce prodotta è rilevata da una CCD camera e visualizzato come picco in un pirogramma.

35 L apirasi, un enzima che degrada i nucleotidi, degrada continuamente tutti i dntp non incorporati e l ATP in eccesso. Non appena la degradazione è completata viene aggiunto un altro dntp Poiché il datp è un substrato naturale della luciferasi, al suo posto viene utilizzato la deossiadenosina- α tio-trifosfato (datps) che viene incorporata efficientemente dalla DNA polimerasi ma non viene riconosciuta dalla luciferasi. Man mano che il processo continua, il filamento di DNA complementare è sintetizzato e la sequenza nucleotidica è determinata dai picchi del pirogramma.