Il sequenziamento genico e le sue applicazioni nella diagnostica molecolare del laboratorio di microbiologia e virologia medica

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1 Il laboratorio di Biologia Molecolare: introduzione alle tecniche e alla loro applicazione Il sequenziamento genico e le sue applicazioni nella diagnostica molecolare del laboratorio di microbiologia e virologia medica Elisabetta Pagani Direttrice reggente Laboratorio Aziendale di Microbiologia e Virologia Comprensorio Sanitario di Bolzano 1 Trento, 26 novembre 2011

2 Biologia molecolare: le metodiche in uso presso il Laboratorio Aziendale di Microbiologia e Virologia PCR end point (nested-pcr, reverse transcriptase PCR) Parvovirus B19 Toxoplasma HIV Provirus Norovirus Sequenziamento HCV genotipo HBV genotipo Resistenze HBV Identificazione microbica (16S) MTC + rif res Tipizzazione Enterovirus Identificazione miceti Tipizzazione neuroaminidasi + emoagglutinina Flu Genogruppi Norovirus 2 Tipizzazione C. difficile Definizione resistenze Aspergillus rtpcr qualitativa HSV1/2, VZV Adenovirus JCV MTC Chlamydia trachomatis Chlamydia pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Enterovirus Influenza A(H1N1, H3N2,H1n1 v)/b rtpcr quantitativa HCMV, EBV BKV HHV6 HBV, HCV, HIV Immunoblot MOTT

3 Storia della sequenza del DNA Avery propone il DNA come materiale genetico Holley sequenza il trna di lievito METODO SANGER (terminazione di catena) METODO MAXAM-GILBERT (degradazione chimica) Miescher osserva per la prima volta il DNA KARY MULLIS Introduce la PCR 1989 Watson e Crick determinano la struttura della doppia elica Vengono sviluppate le tecniche per la sintesi degli oligonucleotidi e per la degradazione chimica del DNA. Viene introdotta l elettroforesi su gel per la Separazione di frammenti di DNA 1980 Il DNA genomico viene clonato nel fago M13 o in vettori plasmidici, nascono i primi Programmi informatici di analisi dei dati, vengono sviluppate nuove tecnologie per il sequenziamento BANCHE DATI!!!!!! 3 Automazione completa Sequenziamento completo del genoma umano 2000 AUTOMAZIONE PARZIALE Vengono sviluppate le prime Apparecchiature per il sequenziamento che impiegano sistemi per la rilevazione della fluorescenza.

4 DEFINIZIONI Sequenziamento Il termine, in biologia molecolare, indica il processo per la determinazione esatta della struttura primaria di un biopolimero (basi nel caso di un acido nucleico, aminoacidi nel caso di proteine) Sequenziamento del DNA Determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono l'acido nucleico Presupposto Ogni microrganismo ha porzioni di genoma comuni ad altri e porzioni esclusive 4

5 Applicazioni in microbiologia e virologia medica Identificazioni: sequenziamento di regioni speciespecifiche (16SrDNA, ITS1-2 ) Identificazioni: sequenziamento di regioni tipospecifiche (genotipi e sottotipi) Resistenze ai farmaci: sequenziamento di regioni in cui possono essere evidenziate mutazioni che individuano fenotipo resistente Studi epidemiologici (fenomeni epidemici, alberi filogenetici) 5

6 It is hard to exaggerate the impact of the polymerase chain reaction. PCR, the quick, easy method for generating unlimited copies of any fragment of DNA, is one of those scientific developments that actually deserves timeworn superlatives like "revolutionary" and "breakthrough." - Tabitha M. Powledge La PCR è una metodica molecolare che si basa sull impiego di un enzima, la Taq Polimerasi, in grado di catalizzare in vitro la reazione di amplificazione di una particolare sequenza di DNA o RNA a partire da una frazione di acido nucleico utilizzato come stampo Kary Mullis 6

7 Metodo enzimatico di Sanger Nucleotidi che bloccano l allungamento del filamento di acido nucleico: la mancanza del gruppo ossidrile in 3 impedisce l attacco al 7 gruppo fosforico del nucleotide successivo

8 Le fasi del sequenziamento Amplificazione (PCR/RT-PCR o clonaggio) Verifica dell amplificato (visualizzazione dei prodotti di PCR/corsa ellettroforetica) Purificazione (digestione enzimatica / precipitazione / gel filtrzione) Verifica Quantificazione Marcatura (PCR di sequenziamento) Purificazione (gel-filtrazione/precipitazione) Elettroforesi (capillare) Analisi dei risultati (elettroferogramma ed allineamenti) 8 8

9 Prima del sequenziamento Scelta del campione (puro) da cui è più indicato estrarre gli acidi nucleici (diretto o dopo isolamento?) Scelta del bersaglio (regione): -sequenza presente in tutti gli organismi che desideriamo tipizzare -sequenza regioni fiancheggianti conservate, ma contenenti regione variabile Messa a punto di una buona PCR (scelta dei primers e delle condizioni di amplificazione) Disponibilità di un database contenente le sequenze con cui si vuole confrontare il bersaglio 9

10 10 ALLA FINE DELLA PCR

11 Verifica dell amplificato (visualizzazione mediante corsa elettroforetica) Camera elettroforetica Gel di agarosio (1-3%) (agarosio, tampone TBE, ovvero Tris-borato in EDTA, etidio bromuro/sybr Green) Colorante Ladder (marker, peso molecolare) Transilluminatore (lampada UV) Movimento di molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico, generato dalla differenza di potenziale (100 V=50mA), creata da un alimentatore di corrente; in tampone alcalino (TBE, ph 8.3) o neutro gli acidi nucleici si comportano come anioni (carica -) e migrano verso il polo positivo; le molecole di DNA passano attraverso i pori del gel e a seconda della loro lunghezza percorrono una distanza più o meno 11 lunga 11

12 12

14 Purificazione dei prodotti di PCR IMPLICA L ELIMINAZIONE DI PRIMER, dntp ED ENZIMA RIMASTI IN SOLUZIONE AL TERMINE DELLA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE SI CONSIGLIA quando la banda è singola EXOSAP-it (reazione enzimatica): esonucleasi I e fosfatasi alcalina (Shrimp Alkalin Phosphatase) degradano primer e dntps, ma non rimuovono sali o altri prodotti secondari della PCR quando le bande sono multiple Estrazione da gel utilizzando colonnine commerciali (ridurre al minimo le dimensioni della banda tagliata; aumentare il numero di lavaggi con la soluzione contenente etanolo; aumentare il tempo della spinnata a vuoto prima dell'eluizione del DNA dalla colonnina)

15 Verifica e quantificazione del prodotto purificato Verifica: visualizzazione dei prodotti di purificazione mediante corsa elettroforetica Quantificazione del prodotto di PCR purificato: spettrofotometria quantitative DNA Ladder

17 SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO (metodo di Sanger) Richiede la presenza di una molecola stampo di DNA a singolo filamento e di un oligonucleotide d innesco (primer) ad essa complementare Il primer si appaia all estremità in 3 -OH del filamento di DNA e rende disponibile il proprio terminale idrossilico per la reazione di polimerizzazione, catalizzata dalla DNApolimerasi La reazione di sequenza prevede l utilizzo una miscela di reazioni contenente i quattro deossinucleotidi trifosfati (dntps) in quantità equimolari e un dideossinucleotide (ddntp) presente in bassa concentrazione 17

18 Nucleotidi terminatori (ddntp) Nucleotidi che bloccano l allungamento del filamento di acido nucleico: la mancanza del gruppo ossidrile in 3 impedisce l attacco al gruppo fosforico del nucleotide successivo Nucleotidi marcati con 32 P (in passato) o molecole fluorescenti (recentemente) 18

19 Quando la catena nascente incorpora un ddntp, la reazione di polimerizzazione si arresta e si ha la terminazione della catena; ciò avverrà più volte, in posizioni diverse della sequenza, generando una serie di frammenti interrotti di lunghezza variabile. 19

20 Produzione dei frammenti (metodo di Sanger) 5 3 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3 5 molecola stampo di DNA a singolo filamento 5 3 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3 5

21 Produzione dei frammenti (metodo di Sanger) 5 oligonucleotide d innesco (primer) 3 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCA 5 il primer si appaia all estremità in 3 -OH del filamento di DNA e rende disponibile il proprio terminale idrossilico per la polimerizzazione 5 3 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT da dc dg dt + DNA Polimerasi 5 3 TTACGTAACGTCA AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3 5

22 Produzione dei frammenti (metodo di Sanger) 5 sintesi del DNA 3 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5 3 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA

23 Produzione dei frammenti (metodo di Sanger) miscela di reazione contenente i deossinucleotidi trifosfati (dntps) in quantità equimolari e i dideossinucleotidi (ddntp) a bassa concentrazione 5 3 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCG 5 3 TTACGTAACGTCA AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGC 3 5 da dc dg dt dda ddc ddg ddt + DNA Polimerasi

24 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGA AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAA AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAAC AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACG AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACGT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACGTC AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA

25 Produzione dei frammenti (metodo di Sanger) 25

26 Quando la catena nascente incorpora un ddntp, la reazione di polimerizzazione si arresta e si ha terminazione, altrimenti l allungamento prosegue; ciò avverrà più volte, in posizioni diverse della sequenza, generando una serie di frammenti interrotti di lunghezza variabile: se il bersaglio è composto da n nucleotidi si avranno frammenti di tutte le lunghezze possibili da 1 a n, separabili mediante corsa elettroforetica Coniugando a ciascun ddntp un diverso marcatore fluorescente è possibile distinguerli e, indipendentemente dalla lunghezza, tutti i frammenti terminanti con A emetteranno fluorescenza di tipo A, quelli terminanti con citosina di tipo C e 26 via di seguito

27 Produzione dei frammenti (metodo di Sanger) Quando la catena nascente incorpora un ddntp, la reazione di polimerizzazione si arresta e si ha terminazione, altrimenti l allungamento prosegue; ciò avverrà più volte, in posizioni diverse della sequenza, generando una serie di frammenti interrotti di lunghezza 27 variabile.

28 28 Fluorocromi

29 29 Fluorocromi

30 PCR di sequenziamento: metodo Sanger o enzimatico Due reazioni parallele, utilizzando in ciascuna, un solo primer (forward o reverse) PRIMER (HPLC-purificati): sovrapposto, meglio se interno, al primer di I amplificazione (forward/reverse) 3,2 pmol reagente per 1 campione RRBigDye1.1/3.1 4 /2 µl Buffer5X 2 /3 µl H2O 3.8 /6.8 µl Primer (1pmol/µl) 3.2µl V intermedio 13 /15 EXOs-product 7/5µl Volume finale 20µl Buffer 5X: tampone di reazione con Mg++ Big Dye Terminator Kit ENZIMA: polimerasi (T-elongazione=60 C) 2 ml DEOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATO (dntps): datp, dctp, dgtp, dttp : precursori del DNA DI-DEOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATO: ddntps, nucleotidi terminator Ready Reaction Mix (2,5X) 4 ml TARGET: amplicone purificato 5 ng/100 bp 30

31 Protocollo di reazione: temperature e tempi Denaturazione iniziale: 96 C Denaturazione: 96 C Annealing: 50 C 25 cicli Elongazione: 60 C evitare temperature di annealing<50 C nel caso di primers con Ta>60 C, eliminare lo step di annealing 96 C, 60 C) aumentare il nr. di cicli se il prodotto di I amplificazione è debole 31

33 Metodi di purpficazione (ddntps non incorporati) 33

34 G e l - f i l t r a z i o n e 34

35 35 Elettroforesi Amplificazione (PCR/RT-PCR o clonaggio) Verifica dell amplificato (visualizzazione dei prodotti di PCR/corsa ellettroforetica) Purificazione (digestione enzimatica / precipitazione / gel filtrzione) Verifica Quantificazione Marcatura (PCR di sequenziamento) Purificazione (gel-filtrazione/precipitazione) Elettroforesi (capillare) Analisi dei risultati (elettroferogramma ed allineamenti)

36 36 Corsa elettroforetica

37 Viene utilizzato un gel ad altissima risoluzione (poliacrilamide 4-6%), in condizioni denaturanti (urea), capace di separare frammenti di DNA che differiscono tra di loro per un solo nucleotide (spessore del gel: 0,3-0,4 mm; lunghezza lastre di vetro: 40 cm circa) Precursori normali del A C G deossiribonucleosidetrifosfato C G T G T CA T G Piccola quantità del A G T A C C A G dideossiribonucleoside- T G A T T trifosfato C Innesco per la DNA T G A polimerasi marcato a fluorescenza 5 3 G C T A C C T G C A T G G A DNA - POLIMERASI C G A T G G A C G T A C C T C T G A A G C G 3 5 Molecola di DNA a singolo filamento L infrequente incorporazione del dideossiribonucletide blocca l ulteriore accrescimento della molecola di DNA da sequenziare G C T A C C T G C A T G G A G C T A G C T A C C T G G A Miscela di molecole di DNA fluorescenti di diversa lunghezza, tutte terminate da A Quattro inneschi fluorescenti di colore diverso incubati nella miscela di nucleotidi contenente un diverso dideossiribonucleosidetrifosfato che termina la catena (A, C, G, T) Miscela di molecole di diversa lunghezza tutte terminate da A Miscela di molecole di diversa lunghezza tutte terminate da C Miscela di molecole di diversa lunghezza tutte terminate da G Miscela di molecole di diversa lunghezza tutte terminate da T A C G T 37

38 Elettroforesi L intensità e la lunghezza d onda delle emissioni fluorescenti vengono captate durante l elettroforesi, quando i frammenti di DNA, eccitati dalla luce laser, passano davanti ad un rilevatore 38

39 39 Elettroforesi

40 40 Il sequenziamento automatizzato (ABI Prism 3130 Genetic Analyzer)

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42 Il sequenziamento automatizzato (elettroforesi capillare) Lo strumento, dopo aver prelevato il prodotto della PCR di marcatura lo sottopone ad elettroforesi all interno di un capillare in vetro-resina di diversa lunghezza a seconda delle esigenze Il capillare, del diametro di 50 mm, contiene un polimero di corsa, automaticamente caricato dal sistema Esistono sistemi a 1, 4, 16 e 96 capillari Un raggio laser colpisce il capillare eccitando i fluorocromi marcanti i frammenti di diversa lunghezza 42 Una cellula fotoelettrica rileva e memorizza i segnali fluorescenti

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44 44 Calibrazioni: spettrale + spaziale

45 45 Analisi dei risultati Amplificazione (PCR/RT-PCR o clonaggio) Verifica dell amplificato (visualizzazione dei prodotti di PCR/corsa ellettroforetica) Purificazione (digestione enzimatica / precipitazione / gel filtrzione) Verifica Quantificazione Marcatura (PCR di sequenziamento) Purificazione (gel-filtrazione/precipitazione) Elettroforesi (capillare) Analisi dei risultati (elettroferogramma ed allineamenti)

46 Elettroferogramma (Sequencing Analysis 5.2 AB) Durante la corsa elettroforetica i frammenti di DNA vengono colpiti da un raggio laser (emissione a 490 nm) Questo provoca l eccitamento dei fluorocromi che marcano i frammenti Ciascuno dei quattro fluorocromi emette ad una lunghezza d onda diversa Una cellula fotoelettrica rileva sequenza, tipo ed intensità delle emissioni luminose Il tutto viene convertito in un sistema grafico La sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi ed il colore del picco corrisponde al tipo di base azotata 46

47 47 Raw data (Sequencing Analysis 5.2 AB)

48 48 ELETTROFEROGRAMMA

49 Analisi dei risultati: qualità 49

50 50 Allineamenti: banche dati

51 GenBank Banca dati ad accesso libero (internet) Circa 50 milioni di sequenze geniche (animali e vegetali) Permette il confronto della propria sequenza in tempo reale: motore di ricerca (programma blast) individua le sequenze con il più elevato grado di omologia Chiunque può depositarvi le proprie sequenze 51

52 52

53 53

54 54 Blast

55 55 Blast

56 56 Blast

57 57 Blast

58 58 Altre banche dati: redom

62 62 Banche dati dedicate: HCV sequence database

65 65 Banche dati dedicate: geno2pheno

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67 Applicazioni: la nostra esperienza Individuazione delle regioni da sequenziare (campione di partenza) Ricerca di una library (database) Definizione del flusso di lavoro Messa a punto e validazione Controlli di qualità Introduzione nella pratica giornaliera 67

68 Applicazioni: la nostra esperienza Determinazione dei differenti genotipi (1-3%) e sottotipi (0.5-1%) virali per HCV (NS5B) Determinazione dei differenti genotipi virali per HBV e individuazione del genotipo resistente a Lamivudina, Adefovir, e/o Entecavir (Tenofovir, Telbivudina)(pol) Identificazioni batteriche (16SrDNA) Identificazioni micobatteri per la speciazione all interno del MTC (gyrb) e definizione delle resistenze alla rifampicina (RNApolβ: rpo/tb) Identificazione dei miceti (ITS) Tipizzazione Enterovirus (5 UTR) Sorveglianza epidemiologica dell influenza (emoagglutinina) Sorveglianza epidemiologica Clostridium difficile (proteina C)

69 Micobatteri OBIETTIVI: 1) rapida distinzione, nell ambito del MTC, tra M. tuberculosis, M. bovis (intrinsecamente resistente alla pirazinamide, farmaco di dimostrata epatotossicità), M. africanum, M. microti; 2) rapida identificazione dei ceppi resistenti alla rifampicina, più diffusi nei pazienti stranieri, ma rilevati anche negli autoctoni. PUNTO DI PARTENZA: 1) le metodiche molecolari in uso (Innolipa) differenziano bene i MOTT, ma non sono in grado di distinguere all interno dell MTC; 2) l esecuzione dell antibiogramma (metodo di riferimento) richiede in media 20 gg.

70 Individuazione della regione: gyrb (no 16SrDNA, no ITS) 70

71 71 Database gyrb

72 S E Q U E N C I N G - A N A L Y S I S

73 Ridom 73

74 74 Ridom

75 75 IL SEQUENZIAMENTO GENICO NELLA PRATICA DEL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA e VIROLOGIA: L ESPERIENZA DEL COMPRENSORIO SANITARIO di BOLZANO e perché non Blast?

76 IL SEQUENZIAMENTO GENICO NELLA PRATICA DEL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA e VIROLOGIA: L ESPERIENZA DEL COMPRENSORIO SANITARIO di BOLZANO Limiti 76

77 Il nostro protocollo/flusso di lavoro Coltura positiva MOTT Innolipa MTC SEQ Rif-RES?

78 Messa a punto e validazione Prof. Proedinger; Division of Hygiene and Medical Microbiology, Department of Hygiene, Microbiology and Social Medicine, Innsbruck Medical University, Innsbruck, Austria. : MIRU genotyping (mycobacterial interspersed repetitive units) 78

79 79 Genotipizzazione HBV: individuazione della regione

80 Primers e condizioni d amplificazione reagente per 1 campione per campioni SYBR GREEN MasterMix primermix(hbpr256+ KL14;10pmol/ µl) 10 µl 2 µl Volume intermedio 12µl DNA estratto (easy mag) 9µl Volume finale 21µl 80

81 Datbase 60 genotipi 81