LA TECNOLOGIA SANGER SEQUENCING RICERCATORE TEAM LEADER: DOTT.SSA VELCA BOTTI

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1 LA TECNOLOGIA SANGER SEQUENCING RICERCATORE TEAM LEADER: DOTT.SSA VELCA BOTTI

2 1953: scoperta del DNA (Watson e Crick) CENNI STORICI 1977: metodo di Sanger per il sequenziamento del DNA (pubblicazione della prima sequenza completa del batteriofago ϕx174) 1984: decifrata la sequenza del virus Epstein-Barr 1987: Applied Biosystems commercializza il primo sequenziatore completamente automatico 1990: National Institute Health (USA) promuove sequenziamento dei genomi E. coli, S. cerevisiae, C. elegans 1990: Progetto Genoma Umano (si conclude nel 2003, con 8 anni di ritardo) Fine del millennio: avvento delle tecnologie Next Generation Sequencing 2014: Sanger sequencing ancora ampiamente utilizzato (lab che non necessitano di alta processività e che richiedono sequenze di circa 800 basi)

3 COS E IL SANGER SEQUENCING E una tecnologia del sequenziamento del DNA che permette di determinare l ordine dei diversi nucleotidi e quindi delle quattro basi azotate (adenina, timina, citosina e guanina) che costituiscono l'acido nucleico. Il sequenziamento del DNA è considerato uno strumento essenziale per la ricerca biologica per correlare il genotipo di un organismo al suo fenotipo.

4 IL SANGER SEQUENCING: REAZIONE ENZIMATICA Reazione detta anche cycle sequencing che ricorda in maniera sostanziale la PCR (Polymerase Chain Reaction) dntp (desossigunaosina trifostafato) ddntp (didesossigunaosina trifostafato) Nel momento in cui l enzima DNA polimerasi incorpora ddntps nella catena nascente si determina l ARRESTO DELLA SINTESI: per questa ragione la tecnica di Sanger viene anche detta metodo dei terminatori di catena.

5 LA LETTURA DEL PRODOTTO DEL SANGER SEQUENCING Oggi il DNA così ottenuto viene letto in moderni sequenziatori automatici a capillari come quello in dotazione all Unità di Ricerca VDNA Barcoding (AB 3500, Lifetechnologies). sequenziatori automatico a 8 capillari elettroforesi a capillari elettroferogramma

6 APPLICAZIONI: INDAGINE DEL DNA MITOCONDRIALE MEDICINA: studio di patologie umane in cui è coinvolto il DNA mitocondriale (DIABETE, CANCRO ecc.), studio dei meccanismi dell invecchiamento MEDICINA FORENSE: strumento per tracciare la matrilinearità PALEONTOLOGIA: per valutare l origine e l evoluzione umana STUDIO DELLA BIODIVERSITA : per indagare le specie viventi DNA BARCODING

7 APPLICAZIONI: DNA BARCODING DIFESA DEI CONSUMATORI per la tracciabilità dei prodotti agroalimentari (intesa come corrispondenza fra le specie animali e vegetali dichiarate come ingredienti di un prodotto) RISPETTO DELLE NORME DOGANALI per analisi di prodotti sospetti per impedire il commercio di specie protette da convenzioni internazionali MONITORAGGIO AMBIENTALE per stilare liste specifiche per il monitoraggio della salute del territorio per l identificazione precoce di specie aliene/invasive Birstein V. J. et al Polyphyly of mtdna lineages in the Russian sturgeon, Acipenser gueldenstaedtii: forensic and evolutionary implications. Conservation Genetics Domingo-Roura X. et al Badger hair in shaving brushes comes from protected Eurasian badgers. Biological Conservation Cini et al A review of the invasion of Drosophila suzukii in Europe and a draft research agenda for integrated pest management. Bulletin of Insectology

8 APPLICAZIONI: DNA BARCODING VALORIZZAZIONE DELLE COLLEZIONI MUSEALI Puillandre N. et al New taxonomy and old collections: integrating DNA barcoding into the collection curation process. Molecular Ecology Resources MEDICINA FORENSE per analisi di sostanze biologiche causa di avvelenamenti umani e animali Bruni I. et al Identification of poisonous plants by DNA barcoding approach. Int J Legal Med. ENTOMOLOGIA FORENSE per il riconoscimento di larve di insetti che colonizzano i cadaveri Veratro comune Meiklejohn, K. A. et al DNA barcoding identifies all immature life stages of a forensically important flesh fly (Diptera: Sarcophagidae) Journal of Forensic Sciences

9 APPLICAZIONI: MICROBIOLOGIA IDENTIFICAZIONE MICROBICA (batteri, virus, funghi) MONITORAGGIO DI MICRORGANISMI AMBIENTALI INDIVIDUAZIONE DI MICRORGANISMI PATOGENI TEST DI ROUTINE PER VALUTARE CONTAMINAZIONI BATTERICHE genotipizzazione batterica gene 16S del rrna genotipizzazione fungina regione D2 del gene 26S del rrna