Applicazioni biotecnologiche in systems biology

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1 Applicazioni biotecnologiche in systems biology Lezione #2 Dr. Marco Galardini AA 2012/2013

2 Contatti Dr. Marco Galardini Dip. Di Biologia Via Madonna del Piano 6, Polo Scientifico S. Fiorentino (c/o Incubatore delle idee) Tel:

3 Systems biology

4 Principali tecnologie di sequenziamento e controllo qualità Lezione #2 Dr. Marco Galardini AA 2012/2013

5 Sequenziamento del genoma Genoma: intera sequenza nucleotidica di un organismo Sequenziamento: determinazione di una sequenza nucleotidica Le tecniche di sequenziamento Generazione 0 Sequenziamento chimico Generazione 1 Dye-terminator Generazione 2 NGS con pre-amplificazione Generazione 3 NGS su singola molecola NGS: Next Generation Sequencing

6 Sequenziamento del genoma Le tecniche di sequenziamento Generazione 0 - Maxam & Gilbert Generazione 1 - Sanger Generazione 2 Pyrosequencing (454), Solexa-Illumina, Solid, Ion Torrent Generazione 3 PACBIO RS, Nanopore

7 Evoluzione del sequenziamento 1977 Frederick Sanger Prima tecnica di sequenziamento 1987 Applyed Biosystems Prima macchina automatica per il sequenziamento del DNA 1998 Phil Green and Brent Ewing Viene pubblicato il softwere Phred per l analisi di sequenze di DNA 1986 Leeroy E.Hoods Prima macchina semiautomatica per il sequenziamento del DNA 1996 Pål Nyrén Nascita del pyrosequencing 2000 Lynx Therapeutics Lancio sul mercato del MPSS e inizio del sequenziamento di nuova generazione (NGS)

8 Evoluzione del sequenziamento 1977 Frederick Sanger Prima tecnica di sequenziamento 1987 Applyed Biosystems Prima macchina automatica per il sequenziamento del DNA Quantità di dati nell unità di tempo 1998 Phil Green and Brent Ewing Viene pubblicato il softwere Phred per l analisi di sequenze di DNA 1986 Leeroy E.Hoods Prima macchina semiautomatica per il sequenziamento del DNA Qualità e controllo dei dati ottenuti Riduzione del costo 1996 Pål Nyrén Nascita del pyrosequencing 2000 Lynx Therapeutics Lancio sul mercato del MPSS e inizio del sequenziamento di nuova generazione (NGS)

9 Automatismi di sequenziamento?

10 Automatismi di sequenziamento Maggiore automazione, industrializzazione del sequenziamento Concentrazione di sequenziatori presso centri genomici (economia di scala) Riduzione del numero di singoli sequenziatori presso laboratori di ricerca Utilizzo della genomica per applicazioni cliniche, farmaceutiche, industriali

11 Incremento della complessità Sanger sequencing Quantità di basi lette Nell unità di tempo Risorse per la lettura ed immagazzinamento delle sequenze NGS

12 Sequenziamento del genoma Le tecniche di sequenziamento Generazione 0 - Maxam & Gilbert Generazione 1 - Sanger Generazione 2 Pyrosequencing (454), Solexa-Illumina, Solid, Ion Torrent Generazione 3 PACBIO RS, Nanopore

13 Generazione 1 - Sanger ovvero l idea geniale dei dideossi!

14 Sanger sequencing: Cycle Sequencing Molecola segnale La bassa percentuale di ddntp fa sì passi del tempo prima che la sintesi venga interrotta dnalc

15 Sequenziamento manuale Di-deossi nucleotidi radioattivi Una lane per ogni nucleotide Esistono sequenziatori automatici che leggono automaticamente i gel di poliacrilamide

16 Sequenziamento automatico Di-deossi nucleotidi fluorescenti Un colore per ogni nucleotide Una singola lane per i 4 nucleotidi Separazione attraverso elettroforesi capillare Lettura nucleotidi tramite laser Macchinari multi-capillari per letture in parallelo

17 Cromatogramma Lunghezza dei frammenti raggiunta: fino a 1000 bp

18 Cromatogramma possibili errori Sovrapposizione fra i picchi Omonucleotidi Difficile separazione fra i picchi Sovrapposizione fra i picchi Necessario un approccio algoritmico per determinare la qualità dei cromatogrammi ed individuare la giusta sequenza

19 Generazione 2 NGS con pre-amplificazione Pyrosequencing (454) Solexa-Illumina Solid (Anche la tecnica Sanger prevede un amplificazione del dna prima del sequenziamento, con successiva ligazione di un primer)

20 NGS, seconda generazione

21 NGS, seconda generazione Viene commercializzata la prima macchina automatica per il pirosequenziamento Prima pubblicazione sul pirosequenziamento Primo sequenziamento automatico Primo sequenziamento semi-automatico (Sanger dye-terminator)

22 NGS, seconda generazione 454 pyrosequencing Viene commercializzata la prima macchina automatica per il pirosequenziamento Illumina (Solexa) Prima pubblicazione sul pirosequenziamento Primo sequenziamento automatico Primo sequenziamento semi-automatico (Sanger dye-terminator) SOLiD Ion semiconductor DNA nanoball Helioscope SMRT/RNAP

23 NGS, seconda generazione 454 pyrosequencing Viene commercializzata la prima macchina automatica per il pirosequenziamento Illumina (Solexa) Prima pubblicazione sul pirosequenziamento Primo sequenziamento automatico Primo sequenziamento semi-automatico (Sanger dye-terminator) SOLiD Ion semiconductor DNA nanoball Helioscope SMRT/RNAP

24 Il Pyrosequencing (o 454) La tecnologia 454 Da 400 a 700 basi per read Circa la metà rispetto al Sanger megabasi ogni 10 ore Più veloce del Sanger Costi medio alti Impossibilità di sequenziare correttamente più di 8 basi identiche consecutive (omonucleotidi)

25 Il Pyrosequencing (o 454) La tecnologia 454 Amplificazione tramite emulsion PCR (empcr) Multiple reazioni di PCR nella stessa provetta Sospensioni acquose in olio Frantumazione DNA Primer di PCR legati a microsfere Intrappolamento microsfere in micropiastra Una microsfera per pozzetto

26 Il Pyrosequencing (o 454) La tecnologia 454 Pirosequenziamento Inserimento di un nucleotide per volta Incorporazione di un nucleotide da parte della DNA polimerasi comporta lo sviluppo di luce Rilevazione da parte di una videocamera

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28 Importante: Cosa succede quando aggiungo ATP?

29 Importante: Cosa succede quando aggiungo ATP? Al posto dell ATP si usa d-alpha-thio triphosphate (non utilizzata dalla luciferasi)

30 Il Solexa-Illumina La tecnologia Solexa, cioè sequencing on-a-chip Circa 100 basi per read 10 milioni di reads per spot Ridotti costi di sequenziamento Profondità di sequenziamento elevata Video Overview

31 Frammentazione + ligazione adattatori Annealing sul chip Amplificazione tramite bridge PCR

32 Amplificazione tramite bridge PCR Formazione di cluster densi e separati Ogni cluster contiene una singola sequenza

33 Aggiunta di nucleotidi fluorescenti Terminatori reversibili (il fluoroforo può essere clivato) Lettura di una base per volta, ma in parallelo su molti cluster

34 Lunghezza dei frammenti raggiunta: 100 basi (in pair-end)

35 Il SOliD Sequencing by ligation No DNA polimerasi Utilizzo dell enzima ligasi Reads di 150 bp massimo (generalmente 35 bp) Massima accuratezza Vengono utilizzati sonde con due basi Ogni base della sequenza viene «letta» due volte Costi bassi Pre-amplificazione con empcr su microsfere Ligazione delle microsfere su un vetrino

36 Sequencing by Ligation 1. Primers hybridize to the P1 adapter sequence on the templated beads. 2. A set of four fluorescently labeled di-base probes compete for ligation to the sequencing primer. Specificity of the di-base probe is achieved by interrogating every 1st and 2nd base in each ligation reaction. 3. Multiple cycles of ligation, detection and cleavage are performed with the number of cycles determining the eventual read length. 4. Following a series of ligation cycles, the extension product is removed and the template is reset with a primer complementary to the n-1 position for a second round of ligation cycles. Lunghezza dei frammenti raggiunta: basi

37 Video

38 Ion Torrent

39 Amplificazione tramite empcr su microsfere (intrappolate in micropozzetti) Utilizzo di normali dntp L incorporazione di un dntp rilascia un protone (H+) Rilevazione della differenza di voltaggio (ΔV) ΔV proporzionale al numero di nucleotidi incorporati

40 Lunghezza dei frammenti raggiunta: oltre 100 basi Previsto nuovo CMOS chip da 400 basi entro dicembre 2011

41 Generazione 3 Oxford Nanopore PacBio Single Molecule Real Time sequencing (SMRT) Sequenziamento a singola molecola di DNA Amplificazione iniziale tramite PCR non necessaria Riduzione di bias dovuti all amplificazione (amplificazione differenziale di alcune parti della sequenza)

42 Oxford Nanopore Tecnologia ancora molto sperimentale Vari metodi per determinare i singoli nucleotidi

43 PacBio RS - SMRT Technology

44 Filmato SMRT Pozzetti con volume litri (zeptolitri) Aggiunta sequenziale di dntp marcati con fluorofori Determinazione incorporazione tramite ZMW (zero-mode waveguide)

45 Lunghezza dei frammenti raggiunta: bp (esperimenti con circa 2.5 kb)

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47 Qualità dei sequenziamenti Dalla reazione alla sequenza

48 Qualità dei sequenziamenti Sequence:??????????????????????????????????

49 Qualità dei sequenziamenti Come è possibile risalire alla sequenza di DNA sequenziata? Necessità di trovare un modo univoco per l interpretazione dei cromatogrammi. E possibile ripetere il processo per milioni di volte? Necessità di sviluppare algoritmi in grado di assegnare ad ogni picco una determinata base in modo automatico.

50 Qualità dei sequenziamenti

51 Qualità dei sequenziamenti G

52 Qualità dei sequenziamenti G C

53 Qualità dei sequenziamenti G C A

54 Qualità dei sequenziamenti G C A G

55 Qualità dei sequenziamenti G C A G C G A Durante l elettroforesi capillare frammenti di lunghezza diversa possono non essere ben separati Lettura simultanea di basi diverse Man mano che il sequenziamento procede verso la fine del segmento di DNA, la qualità andrà a diminuire (anche all inizio) Una bassa qualità può significare una sequenza diversa da quella reale

56 Base-calling algorithm Algoritmo che, data una serie di picchi cromatografici, sia in grado di risalire alla corretta sequenza di DNA che li ha generati ed assegnare ad ogni base una certa «qualità» Phred E l algoritmo più utilizzato. Ad oggi la qualità delle sequenze di DNA viene espressa utilizzando il suo score

57 Base-calling algorithm Vengono presi in considerazione i principali parametri relativi alla forma ed all ampiezza dei picchi; in base a questi viene calcolato un certo valore di qualità relativo ad ogni base.

58 Base-calling algorithm Vengono presi in considerazione i principali parametri relativi alla forma ed all ampiezza dei picchi; in base a questi viene calcolato un certo valore di qualità relativo ad ogni base. La qualità così ottenuta è strettamente legata alla probabilità di ottenere quella determinata base in quel punto del cromatogramma Base A C Quality 40 30

59 Qualità e Probabilità Q = Qualità (Phred Score) P = Probabilità di errore Q = -10log 10 (P) P = 10 -Q/10 BASES A C T G ERROR QUALITY

60 Qualità e Probabilità Q = Qualità (Phred Score) P = Probabilità di errore Q = -10log 10 (P) P = 10 -Q/10 Ad esempio: una qualità pari a 20 si traduce in una probabilità di errore dell 1%, mentre una qualità pari a 30 si traduce in una probabilità dello 0.1% BASES A C T G ERROR 1% 0.1% 0.01% 0.001% QUALITY

61 Qualità e Probabilità BASES A C T G ERROR 1% 0.1% 0.01% 0.001% QUALITY Base scartata Qualità generalmente accettata Importante: Una probabilità d errore dell 1% può sembrare bassa Bisogna tenere conto che vengono sequenziate milioni di basi 1% = basi errate ogni Mb Queste basi errate possono essere confuse per mutazioni -> implicazioni cliniche gravi!

62 Dal sequenziamento al genoma Dalle reads alle sequenze (più o meno) complete

63 Tutte le tecniche di sequenziamento portano alla produzione di molte sequenze corte ( bp) Il genoma batterico più corto è circa 1Mb (500 volte la reads più lunga) Un gene batterico è lungo in media 300 bp Necessario unire insieme le varie reads per ottenere un genoma Trimming, Assembling, Scaffolding