III giorno: Da questo punto in poi, per entrambe le tipologie di campioni, si segue un protocollo comune:

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1 III giorno: 1) Estrazione del DNA genomico da campioni SECCHI e da coltura liquida 2) Preparazione del gel di agarosio 3) Corsa del DNA genomico in gel di agarosio e sua visualizzazione 4) PCR del DNA estratto 5) Analisi in gel di agarosio dei campioni di PCR 1. Estrazione del DNA genomico Il DNA viene estratto attraverso due diversi protocolli, in funzione del campione da cui si parte per l estrazione. 1.a Da campioni SECCHI (protocollo di Tsai et al., 1991; Zhou et al., 1996) A 0.2g di campione conservati il giorno precedente a 4 C aggiungere di 100µl di Buffer 1 e lasciare in agitazione per 10min a temperatura ambiente. Aggiungere 45µl di Lisozima 50 mg/ml, vortexare e lasciare a 37 C, in agitazione, per 30min. In questa fase avviene la digestione della parete Buffer 1: Na 2 EDTA 150mM, NaCl 225mM; ph = 8,50 1.b Da coltura liquida Trasferire per versamento la coltura preparata il giorno precedente (in RB o PCA) in tubi da centrifuga, siglati con RB o PCA (il controllo negativo, se trasparente, si buttta), coltura liquida e nome del gruppo di lavoro Centrifugare a 5000 rpm Eliminare il surnatante per versamento in un Becker, aiutandosi poi con la pipetta per rimuovere tutti i residui di surnatante Risospendere il pellet ottenuto in 540µl di tampone TE 1X ph = 8.00 Trasferire la sospensione in eppendorf siglate RB o PCA o controllo negativo, coltura liquida e nome del gruppo di lavoro Aggiungere 50µl di Lisozima 50 mg/ml e lasciare a 37 C, in agitazione, per 20min. In questa fase avviene la digestione della parete Da questo punto in poi, per entrambe le tipologie di campioni, si segue un protocollo comune: Aggiungere ad ogni campione 7.5µl di SDS al 10% (agente tensioattivo che serve a rompere la parete) e 3µl di Proteinasi K 20 mg/ml (agente he digerisce le proteine di parete), avendo cura di cambiare sempre puntale Vortexare bene e lasciare a 37 C, in agitazione, per 1h Aggiungere 50 µl di Buffer 2 e 20µl di SDS al 10% Lasciare a 65 C, in agitazione, per 1h. Eseguire 2 cicli di congelamento a 80 C (in azoto liquido; lo fa l operatore) e scongelamento a 65 C, vortexando dopo ogni ciclo (fase di heat shock) Centrifugare a per 5 minuti 14000rpm Trasferire il surnatante in nuove eppendorf siglate allo stesso modo dei campioni trattati, cioè: campione secco, e nome del gruppo di lavoro coltura liquida, RB, e nome del gruppo di lavoro coltura liquida, PCA, e nome del gruppo di lavoro

2 Aggiungere SOTTO CAPPA CHIMICA 200µl di miscela fenolo/alcool isoamilico 12:12 per campione (lo fa l operatore) Vortexare i campioni e centrifugare per 5min a rpm. SOTTO CAPPA CHIMICA eliminare il surnatante per versamento, aiutandosi con la pipetta SOTTO CAPPA CHIMICA aggiungere 200µl di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico 12:12:1 per campione (lo fa l operatore) Vortexare per omogeneizzare il campione e rendere possibile lo scambio fra fase estraente e campione Centrifugare per 5 min a rpm. Nel campione si formeranno 3 fasi: una superiore (quella di interesse: è il DNA in soluzione nel fenolo, he lega per interazioni idrofobiche le basi azotate); una intermedia, bianco fioccosa (proteine interferenti precipitate dal cloroformio. Esse, se non vengono ben eliminate, digeriscono il DNA e impediscono l analisi; una inferiore (eccesso di reagente, scarto). Recuperare la fase superiore (DNA in soluzione) con la pipetta tarata ad un volume piccolo, cercando di non tirare su anche le proteine all interfaccia (inquinerebbero e degraderebbero il DNA), e trasferirlo in nuove eppendorf siglate allo stesso modo (campione secco, o coltura liquida in RB o PCA e nome del gruppo di lavoro) Aggiungere 200µl di etanolo 100% per campione, shakerare a mano-non vortexare, per non rompere il DNA. Nel caso si apprezzi un intorbidamento e un aspetto viscoso della soluzione, dovrebbe significare un buon contenuto in DNA Centrifugare per 5min a rpm: il DNA appare come un piccolo pellet bianco 8se in presenza di Sali) o trasparente (preferibile) Eliminare l etanolo per versamento, e poi aiutandosi con la pipetta Lasciar asciugare il pellet di DNA sotto cappa chimica. Risospendere il pellet di DNA in 30µl massimo di TE 1X ph= 8.00 (il volume di TE varia in funzione del pellet di DNA ottenuto Buffer 2: Na 2 EDTA 100 mm, Tris-HCl 400 mm, Na 2 fosfato 400 mm a ph 8.00, NaCl 5,55 M, CTAB 4%; ph 8.00) La presenza del DNA estratto nel campione, prima di amplificare la regione di interesse in PCR, verrà controllata in gel di agarosio 2. Preparazione del gel di agarosio 2.a Teoria dell elettroforesi Molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico si muovono verso l elettrodo di carica opposta: questo processo e noto come elettroforesi. L elettroforesi su gel e una tecnica per separare le molecole sulla base della loro dimensione grazie all effetto setaccio delle maglie del gel che rallenta in misura maggiore molecole più lunghe od ingombranti. In particolare, le molecole di DNA, essendo cariche negativamente, sottoposte in gel al campo elettrico migreranno verso il polo positivo, con una velocità circa proporzionale al log del loro peso molecolare nel caso vengano linearizzate. Frammenti diversi di DNA possono venire separati su gel di agarosio o di poliacrilamide. I gel di poliacrilamide sono efficaci per la separazione di frammenti piccoli (5-500bp), e il potere di risoluzione (separazione delle bande) arriva alla singola base. Questi gel sono piu difficili da preparare e da maneggiare, piu costosi, più tossici. I gel di agarosio hanno un potere di risoluzione minore, ma possono separare frammenti molto piu grandi di DNA (100bp-50kb).

3 L agarosio e uno dei componenti che possono essere separati dall agar, la cui maggior fonte e una particolare alga marina. E un polimero lineare, costituito da D-galattosio e 3.6-anidro galattosio (PM= ). Le catene di agarosio formano eliche che si intrecciano tra loro. E possibile preparare gel di diverse forme e dimensioni: la maggiore o minore porosita dipenderà dalla concentrazione di agarosio (a basse concentrazioni di agarosio si ottengono ovviamente maglie con pori larghi e viceversa) e influenzerà il potere di risoluzione relativo a diversi intervalli di peso molecolare dei DNA analizzati. Il parametro piu importante da considerare e la dimensione delle molecole da separare: molecole piu grandi sono sottoposte a maggiori forze di attrito e incontrano maggiore ostacolo tra i pori del gel rispetto alle molecole piu piccole. Le concentrazioni di agarosio normalmente utilizzate variano dallo 0.5% al 3%. Compute this concentration with to the table below. Add 100 ml of 1 x TAE buffer Amount of Agarose in Gel (%) Efficient Range of Separation of linear DNA Molecules (kb)* , ,7 10-0,8 0,9 7-0,5 1,2 6-0,4 1,5 4-0,2 2,0 3-0,1 Il gel di agarosio si prepara sciogliendo, sotto blanda agitazione, l agarosio in una soluzione tampone (TAE 1X) nel forno a microonde (o su agitatore riscaldante) e versandolo in un opportuna vaschetta munita di pettine per la formazione dei pozzetti di caricamento del DNA; sarà lasciato solidificare sotto cappa chimica.

4 Il campione viene caricato nei pozzetti e fatto migrare Per visualizzare il DNA si usa un colorante fluorescente, il bromuro d etidio (EtBr), che si intercala tra le basi del DNA. Il bromuro d etidio e un potente mutageno, si preleva sotto cappa chimica indossando guanti. La colorazione si puo ottenere immergendo il gel in una soluzione di bromuro d etidio al termine della corsa oppure aggiungendo l etidio al gel di agarosio quando è allo stato liquido ad una temperatura di circa 55 C, così da diminuirne la volatilità. Si preferisce il secondo metodo perche meno inquinante e meno pericoloso. Il complesso DNA-EtBr e fluorescente alla luce UV (assorbe tra 260 e 360nm ed emette a 590nm), per cui le bande di DNA sono visibili posizionando il gel su un transilluminatore UV. Sono visibili agli UV frammenti di DNA fino a 1-10ng di DNA. Se necessario, le bande di DNA possono essere recuperate da gel e sottoposte ad altre manipolazioni enzimatiche. Ai campioni di DNA viene aggiunto un colorante, il blu di bromofenolo, che permette di seguire la corsa elettroforetica, e il glicerolo, che rende più denso il campione e ne permette la deposizione sul fondo del pozzetto. La miscela si chiama loading buffer.

5 Per la corsa, il gel di agarosio viene posto in una cameretta per elettroforesi, immerso nel tampone di corsa (TAE 1X) che lo copre totalmente, e sottoposto a un voltaggio di 70V per circa 1h. Per risalire alle dimensioni dei campioni che vogliamo analizzare, nel gel si carica anche un marker a pesi molecolari noti (anche il marker è addizionato di loading buffer).

6 2.b ESPERIMENTO: Preparazione del gel di agarosio Preparare un gel di agarosio allo 0.8% (servirà per l analisi del DNA genomico estratto): pesare 0.8g di agarosio e scioglierlo in 100ml di TAE nel microonde. Non appena la soluzione di agarosio si raffredda un po, aggiungere 3µl di EtBr, agitare la beuta con la soluzione e versare l agarosio nell apposita vaschetta, preventivamente preparata sotto cappa chimica. Lasciare solidificare il gel sotto cappa chimica. Preparare anche un gel di agarosio all 1.1% (servirà per l analisi dei prodotti di PCR da DNA genomico): pesare 1.1g di agarosio e scioglierlo in 100ml di TAE nel microonde. Non appena la soluzione di agarosio si raffredda un po, aggiungere 3µl di EtBr, agitare la beuta con la soluzione e versare l agarosio nell apposita vaschetta, preventivamente preparata sotto cappa chimica. Lasciare solidificare il gel sotto cappa chimica. 3. Corsa del DNA genomico in gel di agarosio e sua visualizzazione Trasferire 10µl di campione corrispondente (DNA estratto) in eppendorf da 500µl, siglate con campione secco, e nome del gruppo di lavoro coltura liquida, RB, e nome del gruppo di lavoro coltura liquida, PCA, e nome del gruppo di lavoro Ad ogni campione, aggiungere 2 µl di loading buffer cambiando puntale ogni volta Caricare 5µl di miscela già pronta, costituita da marker 1Kb + loading buffer+acqua, vicina alla camera elettroforetica. Caricare tutto il volume dei 3 campioni preparati (campione secco, coltura liquida RB, e coltura liquida, PCA) in 3 pozzetti distinti nel gel di agarosio allo 0.8%, segnando su un foglio comune l ordine di caricamento il gel verrà analizzato al transilluminatore dopo 1h di corsa a 70 mv, per visualizzare la presenza e la concentrazione del DNA genomico estratto 4. PCR del DNA genomico estratto 4.a Teoria della PCR La PCR (Polymerase chain reaction) e una tecnica utilizzata per amplificare una regione specifica di DNA, allo scopo di produrre milioni di copie di segmenti di DNA specifico da utilizzare per vari scopi. Perche la reazione di PCR avvenga sono necessari una sequenza stampo (DNA o RNA già liberi o rilasciati direttamente da cellule, di solito batteriche), oligonucleotidi di innesco (primers) complementari a sequenze note almeno parzialmente e adiacenti alla regione di DNA da amplificare, una miscela di nucleosidi trifosfati e una polimerasi termostabile. In alcuni casi le amplificazioni della PCR vengono eseguite con pool di primers randomizzati. La reazione di PCR si compone di tre fasi, a temperature diverse (ciclo) (Fig. 7): 1. Denaturation (94 C) Le due catene di DNA stampo della doppia elica sono separate mediante denaturazione al calore e i due filamenti così separati (templato) sono accessibili ai primers. 2. Annealing (di solito tra C) Per iniziare il processo e essenziale che i primers si leghino al DNA, ma questo non e possibile alla temperatura della prima fase, quindi si calcola la temperatura di melting (Tm) dei primers (Tm=4GC+2AT ; è il modo più semplice per farlo, anche se non sempre il più corretto), in modo che i primers possano ibridizzare al filamento che si vuole amplificare. I primers sono in eccesso

7 rispetto al templato durante tutto il processo; in questo modo, i filamenti di DNA bersaglio si appaieranno prevalentemente con le molecole di primers piuttosto che tra loro. 3. Extension (74 C) In questa fase si completa la sintesi del nuovo DNA grazie alla reazione già iniziata da una DNA polimerasi termostabile (ad es. quale?) nella fase precedente in presenza della miscela di nucleosidi trifosfati (perché si innalza la temperatura a 74 C?). Partendo dai primers, la polimerasi legge il filamento stampo e lega i nucleosidi al DNA complementare. Si conclude così un ciclo di PCR. Alla fine di un ciclo ciascun frammento di DNA e stato duplicato; il ciclo puo essere ripetuto molte volte (nel nostro caso 38) e ogni pezzo di DNA sintetizzato ex-novo funge da stampo, ottenendo così una produzione esponenziale di DNA specifico. Fig. 7

8 4.b ESPERIMENTO: PCR del DNA genomico estratto i) La tecnica della PCR verrà utilizzata per analizzare la presenza di Eubatteri nei campioni prelevati, unendo DNA genomico estratto da campionamenti diversi (precedentemente controllati per qualità del DNA e resa di estrazione) per aumentare la resa di PCR. La preparazione del campioni verrà effettuata seguendo la Tabella, in eppendorf da 500µl siglata con campione secco, campione da coltura liquida o controllo negativo e nome del gruppo di lavoro. Il controllo negativo è tutto il mix da PCR ed acqua al posto del DNA. Aggiungere nell ordine i reagenti indicati (mantenere tutto in ghiaccio fino al momento dell aggiunta della Taq polimerasi-aggiunta dall operatore) Reagenti DNA da campione secco DNA da coltura liquida Controllo negativo Buffer 10x 5 µl 5 µl 5 µl MgCl 2 25 mm 3 µl 3 µl 3 µl dntp (25mM ciascuno) Primer forward (10pmol/µl) Primer reverse (10pmol/µl) 1 µl 1 µl 1 µl 7 µl 7 µl 7 µl 7 µl 7 µl 7 µl H 2 O µl µl 26.5 µl DNA 5-10 µl 5-10 µl _ Enzima Taq Polimerasi (5U/µl) 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl PRIMERS UTILIZZATI: SG-749f 5 -ACTGGCTAATTATGTAATG-3 forward SG-749r 5 -ATAATTATCCATTGATTTCG-3 reverse Il frammento atteso è un amplificato di 749 bp, e serve ad identificare il B. Cereus Programma di amplificazione (ottimizzato da dati di letteratura): 94 C x 4 denaturazione iniziale 94 C x 1 denaturazione 50 C x 1 appaiamento 38x cicli 72 C x 2 estensione 72 C x 5 per completare l allungamento tenere a 4 C (la macchina da PCR è già settata a questo scopo, per mantenere la temperatura)

9 ii) Preparare un controllo positivo di reazione, cioè una PCR ad alta efficienza, per ulteriore comprova della buona manualità dello studente e riuscita dell esperimento Per il controllo positivo, verrà amplificato il costrutto 252-CAT, ottenuto per ligazione fra il plasmide p252 e il gene che codifica per la subunità catalitica della PKA di lievito Il costrutto è stato scelto in quanto il DNA plasmidico, essendo DNA circolare, risulta meno complesso da amplificarsi rispetto al DNA genomico che, a causa della sua struttura a gomitolo, sarebbe molto più complicato da amplificare nelle stesse regioni. Preparare (alcuni gruppi di lavoro a scelta) anche un controllo negativo per questo programma di PCR Reagenti 252 CAT Controllo negativo Buffer 10x 5 µl 5 µl MgCl 2 25 mm 5 µl 5 µl dntp (25mM ciascuno) Primer forward (10pmol/µl) Primer reverse (10pmol/µl) 2 µl 2 µl 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl H 2 O 31.5 µl 32.5 µl DNA 1 µl - Enzima Taq Polimerasi (5U/µl) 0.5 µl 0.5 µl Programma di amplificazione: 95 C x 5min denaturazione iniziale 95 C x 2min denaturazione 70 C x 2min appaiamento 2 x cicli (perché??) 72 C x 2min estensione 95 C x 1min denaturazione 68 C x 1min appaiamento 33 x cicli 72 C x 1min estensione 72 C x 10min per completare l allungamento tenere a 4 C (la macchina da PCR è già settata a questo scopo, per mantenere la temperatura) Il giorno seguente, al termine della reazione di PCR, il prodotto della reazione verrà analizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto precedentemente per il DNA genomico.

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