Principali tecniche di base

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3 Principali tecniche di base Enzimi di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione (Southern blotting) PCR (Polymerase Chain Reaction) (Sequenziamento)

4 Tecniche di base Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction)

5 Enzimi di restrizione Enzimi provenienti da batteri Svolgono azione protettiva, degradano il DNA di virus

6 DNA/RNA virale Enzima di restrizione Cellula batterica DNA

7 Enzimi di restrizione Enzimi provenienti da batteri Svolgono azione protettiva, degradano il DNA di virus Tagliano specifiche sequenze di DNA Di regola, riconoscono sequenze palindromi di 4-8 pb

8 Enzimi di restrizione: due tipi di tagli digestione con: EcoRI GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G Sticky ends SmaI CCCGGG GGGCCC CCC GGG GGG CCC Blunt ends

9 Nome Batterio di prov. Sito di ric. Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H G GATCC Eco RI Eschericia coli RY13 G AATTC Hind III Haemophilus influenza Rd A AGCTT Nae I Nocardia aerocolonigenes GCC GGC Pst I Providencia stuartii CTGCA G Sma I Serratia marcescens CCC GGG

10 Enzimi di restrizione Tagliano il DNA sempre in corrispondenza dello stesso sito Producono frammenti di DNA polimorfici Utili per inserire DNA estraneo nel genoma di un ospite

11 Tecniche di base Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction)

12 Elettroforesi su gel Utilizza un campo elettrico Il DNA è caricato negativamente e migra in un campo elettrico Separa frammenti di DNA in base alla dimensione La separazione avviene in una matrice di gel Permette la visualizzazione dei frammenti di DNA

13 Elettroforesi su gel ds DNA direzione della migrazione Digestione con enzima di restrizione -+ +

14 Tecniche di base Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction)

15 Ibridizzazione Una sequenza di DNA si appaia con una sequenza nucleotidica complementare Si denatura il DNA col calore (singola elica) Riducendo la temperatura le sequenze complementari si appaiano (re-annealing o ibridizzazione)

16 Probe o sonda marcata DNA in esame a singola elica

17 Sonda o probe (sequenza nota) DNA in esame sequenza DNAa in esame singola elica La sonda di DNA (a singola elica) si lega (ibridizza) con la sequenza complementare se presente nel DNA in esame.

18 Per evidenziare l avvenuta ibridizzazione si utilizza la metodica del: Southern blotting (Ed Southern 1975) Trasferimento dei frammenti di DNA da un gel ad una membrana di nitrocellulosa Ibridizzazione con probe (sonda) di DNA radiomarcato Visualizzazione di specifici frammenti di DNA

19 Separazione frammenti in gel di agarosio Carta da filtro Nitrocellulosa Nitrocellulosa Gel Spugna Soluzione alcanina Ibridizzazione con probe radiomarcato Autoradiografia DNA in esame Digestione con enzimi di restrizione Creazione di frammenti Southern blotting DNA totale Probes specifici

20 Tecniche di base Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction)

21 Polymerase Chain Reaction (PCR) La PCR è un potente strumento per amplificare il DNA, in milioni di copie, mediante la ripetizione della replicazione di una molecola stampo, in un breve periodo di tempo. Il processo utilizza sets di oligonucleotidi specifici (primers), sintetizzati in vitro, per innescare la sintesi di DNA. NB= Il disegno dei primers (inneschi) dipende dalla sequenza del DNA che si vuole analizzare.

22 PCR La metodica è ripetuta per una serie di cicli (usualmente 20-50) durante i quali lo stampo di DNA viene sottoposto a una alta temperatura (denaturazione), quindi la temperatura viene abbassata e ha la sintesi di nuovo DNA sullo stampo innescata dall azione guida dei primers sulle sequenze complementari di stampo mediata dalla DNA-polimerasi in presenza di nucleotidi. Il procedimento è stato automatizzato grazie all impiego di una polimerasi termostabile, la Taq polimerasi DNA pol

23 PCR I prodotti della PCR sono poi analizzati mediante separazione su gel di agarosio seguito da colorazione con etidio bromuro e visualizzazione con transilluminatore a UV.

24 PCR MW MW

25 Pcr.exe

26 PCR Sequenziamento del DNA secondo Sanger (Chain termination)

27 stampo stampo di DNA

28 stampo Allo st am viene a po di DNA g miscel giunta una ad desoss ei quattro in quattro ucleotidi e d i dideso ss (nucleo inucleotidi ti ognun di modificati, o marc ato co un fluo n rocrom o di colore di rappor verso) in to 4:1

29 stampo DNApol..si prim aggiu n con ers o ge D N PC una n pportu A po R lim orm ni. S ale i pr erasi o rea e zio cede ne di

30 stampo DNApol..si prim aggiu n con ers o ge D N PC una n pportu A po R lim orm ni. S ale i pr erasi o rea e zio cede ne di Vengono allestite 4 reazioni in contemporanea

31 stampo DNApol A s com ullo s t per plem ampo e ins caso ntare la sin, e t blo risce la DN proc esi de ed cc a u A l la r n dide polim e fin nastr o o eaz s e ion ossin rasi a che e. uc l non, eot ide c he

32 stampo DNApol A s com ullo s t per plem ampo e ins caso ntare la sin, e t blo risce la DN proc esi de ed cc a u A l la r n dide polim e fin nastr o o eaz s e ion ossin rasi a che e. uc l non, eot ide c he

33 stampo DNApol A AC Il pr o a ch cesso r e vien un nu iprende o e reaz inseri vo dd fino non to e i nuo one si la b vo, e co locca d sì v ia i

34 stampo DNApol A AC ACC

35 stampo DNApol A AC ACC ACCC

36 stampo DNApol A AC ACC ACCC ACCCT

37 stampo DNApol A AC ACC ACCC ACCCT ACCCTT

38 stampo DNApol A AC ACC ACCC ACCCT ACCCTT ACCCTTG

39 stampo DNApol A AC ACC ACCC ACCCT ACCCTT ACCCTTG ACCCTTGG

40 DNA sequencing automatizzato