Tecniche per il sequenziamento degli acidi nucleici

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1 Tecniche per il sequenziamento degli acidi nucleici

2 Nel 1965 viene determinata la prima sequenza completa di un Acido Nucleico: il trna dell alanina di lievito (78 nucleotidi) 1971: prima mappa di restrizione (individuazione della disposizione dei geni sul genoma mediante enzimi di restrizione) del DNA circolare di SV40 (11 frammenti di restrizione). Nel 1975 viene sequenziato il primo genoma completo: l RNA del fago MS2 (3568 nucleotidi). 3 geni separati da pochi nucleotidi Alle estremità 2 lunghe (129 e 174 basi) regioni non tradotte

3 Il Progetto Genoma (inizio fine 2003) Department of Energy and the National Institutes of Health Scopi del Progetto determinare le sequenze delle circa 3x10 9 coppie di basi di cui é costituito il DNA umano identificare tutti i circa ~10 5 geni geni del DNA umano registrare tutta l informazione in Banche Dati sviluppare strumenti per l'analisi dei dati raccolti trasferire le tecnologie sviluppate ai settori privati indirizzare le questioni etiche, sociali e legali che originino dallo svolgimento del progetto

4 Operazioni preliminari al sequenziamento Molecola troppo grande taglio in punti definiti DNasi completamente aspecifiche impossibile tagliare in punti specifici RNasi specificità strutturale Enzimi di restrizione

5 La scoperta degli enzimi di restrizione DNA E.coli di ceppo B in E.coli di ceppo C digestione 1966: si osserva la sopravvivenza di un DNA virale in E.coli enzima di modificazione basi metilate enzima di restrizione

6 sono stati identificati più di 150 siti di restrizione specifici sequenze specifiche di 4-8 basi casuale 1/256 1/ GTPy PuAC 3 3 CAPu PyTG 5 I frammenti di DNA tagliati dagli REs (restriction enzymes) possono essere separati, in base alle loro dimensioni relative, utilizzando l lettroforesi su gel di agaroso

7 I plasmidi sono utilizzati come vettori di clonaggio un frammento di DNA, proveniente da altra sorgente, é integrato nel plasmide (plasmide chimera)

8 Costruzione e clonazione di molecole di DNA ricombinante I passi sono: Costruzione di una molecola ricombinante (plasmide)

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10 taglio al centro del sito di riconoscimento frammenti ad estremità piatte taglio sfalsato frammenti ad estremità coesive CCGC GG GG CGCC CCGC CGCC DNA ricombinante

11 Costruzione e clonazione di molecole di DNA ricombinante I passi sono: Costruzione di una molecola ricombinante (plasmide) Introduzione nelle cellule ospite (batteri mutanti che non degradino rapidamente il DNA estraneo) Selezione e clonazione delle cellule che portano il DNA ricombinante

12 Costruzione e clonazione di molecole di DNA ricombinante I passi sono: Costruzione di una molecola ricombinante (plasmide) Introduzione nelle cellule ospite (batteri mutanti che non degradino rapidamente il DNA estraneo) Selezione e clonazione delle cellule che portano il DNA ricombinante

13 moltiplicazione genica clonaggio molecolare DNA ricombinante utilizzando plasmidi e fagi come vettori Molti batteri contengono uno o piú plasmidi v Molecole di DNA circolare a doppia-elica v # coppie di basi (bp): da 3000 a v unitá autonoma di replicazione v opzionale per la cellula ospite (resistenza agli antibiotici)

14 Plasmidi come vettori di clonaggio un frammento di DNA, proveniente da altra sorgente, é integrato nel plasmide (plasmide chimera) plasmide modificato é inserito in una cellula di E.coli le cellule con il plasmide chimera sono individuate dalla loro resistenza ad un farmaco l insieme dei discendenti di queste cellule é un clone I plasmidi sono utilizzati come vettori d espressione esprimendo il gene inserito si può produrre una proteina di interesse medico (es: insulina)

15 Fotografie al microscopio elettronico Il plasmide psc101: il primo usato per clonare DNA Il fago filamentoso M13

16 Fago lambda come vettore di clonaggio

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18 Nota bene: Amplificazione di DNA mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) Si può amplificare una sequenza di DNA di qualsiasi origine (virus, batteri, organismi superiori) centinaia di milioni di volte in un ora (con la tecnica del DNA ricombinante ci sarebbero voluti molti giorni).

19 Polymerase Chain Reaction, PCR K.Mullis º Ciclo 2º Ciclo A partire dal 3º ciclo, ad ogni ciclo il numero di molecole di DNA a doppia elica raddoppia. All n-esimo ciclo ci saranno quindi N=2 n-2 molecole di DNA a doppia elica 3º Ciclo

20 Metodo di Maxam e Gilbert (o metodo del taglio chimico) marcatura del DNA ad una estremità con 32 P taglio a livello di uno dei 4 nucleotidi elettroforesi autoradiografia polinucleotide chinasi inserisce 32 P al terminale 5

21 Esempio Sequenza marcata 5-32 P- GCTACGTA-3 Frammenti radioattivi Taglio a livello di A: 32 P- GCT 32 P- GCTACGT Taglio a livello di G: 32 P- GCTAC Taglio a livello di C: 32 P- G 32 P- GCTA Taglio a livello di T: 32 P- GC 32 P- GCTACG

22 Diagramma schematico di un autoradiografia su gel dei frammenti radioattivi prodotti dai tagli specifici A G C T

23 Autoradiografia di gel che mostra frammenti marcati prodotti dal taglio chimico

24 Metodo di Sanger (o dell interruzione controllata) copiatura della sequenza a singolo filamento blocco della crescita ad opera di una miscela di incubazione contenente i 4 nucleosidi 3P marcati un analogo 2,3 -dideossi di uno di essi P-P-POCH 2 elettroforesi DNA polimerasi I e primer autoradiografia H H H O base H H 2 3 H

25 Variante del metodo di Sanger marcatura dei primer di ciascuna delle 4 miscele con sonde fluorescenti a λ diversi spettri di fluorescenza elettroforesi blu verde giallo viola

26 Batteri: ospiti ideali per l amplificazione di molecole di DNA produzione di numerose proteine procariotiche ed eucariotiche Molti geni eucariotici sono espressi correttamente solo in cellule eucariotiche L introduzione del DNA ricombinante in cellule eucariotiche permette di studiare, per esempio, in che modo i geni vengono attivati e disattivati durante lo sviluppo dell embrione (differenziazione)

27 DNA-computing

28 La macchina di Turing (Alan Turing, 1936)* Un meccanismo (finite control) si muove tra una coppia di nastri:. legge le istruzioni da un nastro (input tape). scrive il risultato sull altro nastro (output tape) La replicazione del DNA La DNA polimerasi scorre lungo un filamento del DNA. legge ciascuna base sul filamento. scrive il suo complemento sul filamento nuovo Leonard M. Adleman (1994): macchina di Turing DNA? *dieci anni prima della comparsa dei computers!! 1944: electronic discrete variable automatic computer (EDVAC)

29 La Tesi di Church &Turing (Alonzo Church & Alan Turing) Universalità : la macchina di Turing (= qualsiasi computer) può calcolare qualsiasi cosa sia calcolabile, nell ipotesi che ci sia sufficiente tempo e sufficiente memoria L algoritmo con cui viene fatto il calcolo deve soddisfare i seguenti requisiti 1. L algoritmo deve consistere di un set finito di istruzioni descritte con un numero finito di simboli 2. L algoritmo produce il risultato in un numero finito di steps 3. L algoritmo può, in teoria, essere operato da un umano con solo carta e penna 4. La sua esecuzione non richiede un intelligenza umana tranne quella necessaria a capire le istruzioni ed eseguirle

30 DNA Computing La sfida computazionele risolvere gli NP-problems P-problems possono essere risolti in un tempo polinomiale (N k ) NP-problems Non-standard Polynomial problems il tempo per testare una ipotesi (ansatz) è polinomiale, ma il numero di possibili prove è esponenziale (e N ) se disponessi di un computer parallelo con un numero esponenzialmente grande di nodi il tempo di calcolo sarebbe polinomiale Ovviamente P-problems NP-problems* il problema di decidere se l inclusione è stretta è uno dei problemi più importanti della matematica

31 Esempi di problemi NP (completi) Il problema del commesso viaggiatore (Hamilton path problem) Colorare un grafo connesso con 3 colori, senza vertici adiacenti dello stesso colore Problemi di consistenza (SAT-problems = SATisfability-problems) Minimizzazione di una hamiltoniana di spin completo se si trova un algoritmo (efficiente) per risolvere un problema NP completo questo potrà essere utilizzato per risolvere ogni altro problema NP

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33 DNA computer permette di risolvere problemi NP in un tempo polinomiale strumenti molecolari naturali & artificiali appaiamento alla Watson-Crick DNA-polimerasi (+ primer) DNA-ligasi endonucleasi di restrizione sintesi (artificiale) di DNA elettroforesi su gel

34 Hamilton Path Problem Connessioni orientate Vertici Grafo Esempio di algoritmo (non efficiente) Dato un grafo con n vertici 1. generare un insieme di cammini casuali 2. per ciascun cammino a. verificare che cominci dal vertice di partenza e finisca nel vertice di arrivo; altrimenti rimuoverlo b. verificare che il cammino passi esattamente per n vertici; altrimenti rimuoverlo c. per ogni vertice verificare che il cammino passi per quel vertice; altrimenti rimuoverlo 3. Se l insieme non è vuoto: c è un cammino di Hamilton. Se l insieme è vuoto: no

35 Hamilton path: Roma-Parigi-Madrid-Berlino Madrid VOLO Berlino Roma Parigi 4 vertici (= città) 6 connessioni (= voli) Roma = vertice di partenza Berlino = vertice di arrivo CITTA SEQ. DNA COMPL ROMA ACTT GCAG TGAA CGTC PARIGI TCGG ACTG AGCC TGAC MADRID GGCT ATGT CCGA TACA BERLINO CCGA GCAA GGCT CGTT SEQUENZA # VOLO ROMA-PARIGI ROMA-BERLINO PARIGI-MADRID PARIGI-BERLINO PARIGI-ROMA MADRID-BERLINO GCAGTCGG GCAGCCGA ACTGGGCT ACTGCCGA ACTGACTT ATGTCCGA

36 Come si procede in pratica: 1. Sintesi* delle sequenze complementari ai nomi delle città e delle sequenze con i numeri dei voli (i nomi delle città non sono necessari) 2. Nella stessa provetta: un pizzico (circa molecole) di ognuna delle diverse sequenze, acqua, ligasi, sali, etc. In circa 1 sec si ha in mano il risultato * Occorrono pochi giorni per ricevere una provetta con circa molecole di DNA tutte (o in gran parte) aventi la sequenza richiesta. Una sequenza di 20 basi costa circa 25$. Si possono facilmente ottenere sequenze lunghe anche 100 basi.

37 Algoritmo: passo 1 Cosa succede nella provetta a. il volo Roma-Parigi (GCAGTCGG) ed il complemento del nome Parigi (AGCC TGAC) si incontrano per caso. b. la fine della 1 a e l inizio della 2 a sono complementari e si appaiano c. questo complesso incontra il volo Parigi-Madrid (ACTGGGCT) d. la 1 a parte di questo è complementare all ultima del complesso e si appaia e. e così via GCAGTCGG AGCCTGAC GCAGTCGGACTGGGCT AGCCTGAC... La provetta conterrà sequenze relative a cammini casuali.

38 Numero elevatissimo di cammini (sequenze) se esiste, almeno uno sarà quello di Hamilton tutti i cammini sono stati generati contemporaneamente (elevato parallelismo) ci sono (anche) circa molecole che traducono cammini che non sono quello di Hamilton devono essere eliminati

39 Algoritmo: passo 2a Eliminare le molecole che non cominciano con la città di partenza e non finiscono con la città di arrivo. Polymerase Chain Reaction (PCR) con molte copie delle sequenze. complemento del nome della città di partenza (TGAA). del cognome della città di arrivo (GCAA) [primers*] 5 ACTT 3 3 TGAA 5 si producono molte copie solo dei complementi di tutte quelle molecole la cui sequenza comincia con il nome della città di partenza * segnalano alla DNA polimerasi dove cominciare la replicazione alla Watson e Crick

40 5 CGTT TGAA 3 3 GCAA ACTT 5 Roma: ACTT GCAG Berlino: CCGA GCAA si producono molte copie solo dei complementi (prodotti nel precedente passo e che quindi cominciano tutti con il complemento del nome della città di partenza) di tutte quelle molecole la cui sequenza comincia con il complemento del cognome della città di arrivo le molecole moltiplicate da PCR sono quindi quelle che cominciano con il nome della città di partenza e finiscono con il cognome della città di arrivo

41 Algoritmo: passo 2b Con l elettroforesi seleziono solo quelle molecole che hanno la lunghezza (numero di vertici) giusta. Nell esempio: 24 basi Algoritmo: passo 2c i. Si attacca al complemento del nome di una delle città intermedie una microscopica pallina di ferro. ii. Si mette in soluzione e si promuove l appaiamento. iii. Si usa un magnete per attrarre solo le molecole attaccate alla pallina e le altre vengono lavate via. iv. Si stacca la pallina di ferro v. Si ripete la stessa operazione a partire da (i) per le altre città intermedie Algoritmo: passo 3 PCR seguito da elettroforesi e sequenziamento Nota: se la provetta è vuota: non ci sono cammini di Hamilton

42 Passo 2c

43 Vantaggi dei computers a DNA Capacità di Memoria: Parallelismo: 1gr DNA (1cc) = 10 9 CD numeri di volo connessi in 1 sec Efficienza energetica: DNA: 1 joule/10 19 operazioni di legame supercomputers: 1 joule/10 9 operazioni...però, per conoscere il risultato, ottenuto in 1 sec, ci è voluta circa 1 settimana!...e soprattutto, il numero di catene di DNA che devono essere prodotte a caso cresce esponenzialmente con il numero di variabili (nodi) i problemi NP non hanno veramente trovato una soluzione!

44 Perchè il computer a DNA non ha rimpiazzato quello al silicio? DNA = macchina di Turing? Abbastanza più complicato Vantaggi del DNA: parallelismo massivo, numero esponenzialmente grande di processori (più DNA nel beaker!!). Vantaggi del silicone: versatilità, disponibilità, durata, facilità d interfacciamento anni di sviluppo di algoritmi e tecnologie per il silicio non facilmente trasferibili al computer a DNA