Mutagenesi: introduzione di alterazioni in una sequenza nucleotidica. Mutagenesi random: le mutazioni avvengono a caso su un tratto di DNA.

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1 Mutagenesi: introduzione di alterazioni in una sequenza nucleotidica Mutagenesi random: le mutazioni avvengono a caso su un tratto di DNA. In genere si ottengono trattando il DNA con agenti chimici (es. Hydroxylamine). La miscela di mutanti ottenuta viene poi selezionata e, tramite sequenziamento, si identificano le mutazioni di interesse. Sono stati messi a punto diversi metodi per introdurre mutazioni in un gene clonato. Tutti questi impiegano enzimi o reattivi chimici in grado di degradare, tagliare o sintetizzare il DNA. Le mutazioni possono essere raggruppate in: Semplici delezioni o inserzioni di una o più basi Sostituzioni di una o più basi Frameshifts Mutagenesi sito-specifica: introduzione di mutazioni in siti predeterminati del DNA. In questo caso, non si dovrebbe ottenere una popolazione mista di mutanti, ma una popolazione di mutanti portanti tutti la stessa mutazione. E buona norma, comunque, verificare sempre l avvenuta mutazione tramite sequenziamento. 1

2 Attualmente il metodo più usato per la mutagenesi sito-specifica è quello che fa uso della PCR. Mutagenesi tramite PCR: Singoli errori di appaiamento presenti all interno dei primers possono essere incorporati nella molecola stampo durante la reazione di amplificazione. Si scrivono due primers che appaiano su filamenti opposti sulla stessa regione che si intende mutare. Durante la reazione di PCR si producono molecole di DNA che portano la stessa mutazione nella regione comune. Il vantaggio di tale metodo è che il DNA stampo viene poi eliminato tramite digestione con l enzima DpnI. Solo lo stampo viene digerito perchè metilato. Il DNA mutato resta intatto e si usa per trasformare cellule ospiti producendo la mutazione desiderata con un efficienza del 90%. 2

3 Effetti delle mutazioni sulla struttura delle proteine mutazione gene O trascrizione mrna traduzione La Traduzione ha due possibili esiti: (1) un cambio nella sequenza aminoacidica o (2) nessun cambiamento. TB A.Cambiamenti di una singola base Un cambiamento in una singola base di DNA: 1. Mutazioni silenti 2. Mutazioni missenso 3. Mutazioni nonsenso 1. Mutazioni Silenti DNA...TAC......ATG... mutazione...tat......ata... RNA Polipeptide...UAC... tirosina...uau... tirosina Nessun cambiamento nel polipeptide 3

4 2. Mutazioni Missenso DNA...TAC......ATG... mutazione...aac......ttg... RNA Polipeptide...UAC... tirosina...aac... asparagina Un aminoacido è cambiato nel polipeptide. 3. Mutazioni Nonsenso (la mutazione resulta in un codone di stop) DNA...TAC......ATG... mutazione...tag......atc... RNA...UAC......UAG... Polipeptide tirosina stop codon Si produce un polipeptide troncato. B. Delezioni Una o più basi vengono perse ATGAAAGAG... ATGGAG... Risultati possibili a. aminoacidi o polipeptidi possono essere persi b. frameshifts può avvenire 4

5 C. Inserzioni Uno o più basi vengono aggiunte ATGGAG... ATGAAAGAG... Possibili resultati a. aminoacidi o polipeptidi possono essere inseriti b. frameshifts può avvenire D. Frameshift mutazioni Inserzioni o delezioni che cambiano il frame di lettura ATGCAAGTTG... delezione di una coppia di basi ATGAAGTTG... Due cambiamenti nel polipeptide sono possibili: (1) tutti gli aminoacidi a valle della mutazione cambiati, (2) una proteina troncata (più breve) viene prodotta. DNA può avere 3 frames di lettura: A T G C A A G T T G A A T G C A A G T T G A #1 met gln val A T G C A A G T T G A #2 cys lys leu A T G C A A G T T G A #3 ala ser STOP 5

6 Le mutazioni di frameshift cambiano il frame di lettura ATGCAAGTTGA. met gln val delezione di una singola base ATCAAGTTGA ile lys leu (Frameshifts avviene solo se l inserzione o la delezione è in un porzione codificante per una proteina.) Effetto delle mutazioni in una sequenza amminoacidica: sequenza wild type: 5 -ATG CCT TCA AGA TGT GGG CAA-3 Met Pro Ser Arg Cys Gly Gln Mutazione silente: 5 -ATG CCT TCA AGA TGT GGA CAA-3 Met Pro Ser Arg Cys Gly Gln Mutazione missenso: 5 -ATG CCT TCA GGA TGT GGA CAA-3 Met Pro Ser Gly Cys Gly Gln Mutazione non senso: 5 -ATG CCT TCA AGA TGA GGA CAA-3 Met Pro Ser Arg Stop Gly Gln Frame shift in seguito a delezione: 5 -ATG CCT TCA AGT GTG GGC AA-3 Met Pro Ser Ser Val Gly etc III. Effetti delle mutazioni sulla funzione di una proteina 1. Nessun effetto (comune) 2. Perdita di funzione (comune) 3. Parziale perdita di funzione (rara) 4. Eventuale perdita di funzione 5. Cambio di funzione (raro) 6. Recupero della funzione (reversione) 6

7 1. Nessun effetto (comune) A seconda della proteina, fino all 80% degli aminoacidi possono non avere nessun ruolo funzionale wild type (proteina normale) Proteina mutata 2. perdita di funzione (comune) Esempi: a. un cambiamento in un aminoacido che partecipa direttamente alla catalisi (cambio nel sito attivo) wild type (proteina normale) Proteina mutante 2. Perdita di funzione b. Un cambiamento in un aminoacido che causa un alterazione della struttura della proteina Proteina wild type misfolded Proteina mutante aminoacidi degradazione 7

8 3. Parziale perdita di funzione, debole" (comune) Riduzione dell attività catalitica di un enzima dovuta ad una variazione di struttura e/o di stabilità. wild type (normale) proteina Proteina mutante 4. Potenziale perdita di funzione (comune) Es: mutanti sensibili al calore 30 C 42 C foldata proteina mutante misfolded degradazione amino acidi 5. Cambio di funzione (rara) Es. cambio in specificità wild type proteina Converte il maltosio in 2 molecole di glucosio proteina mutante converte il lattosio a glucosio e galattosio 8

9 6. Ripristino della funzione "mutazione inversa" (rara) Proteina mutante Non funzionale una seconda mutazione funzionale a) Mutazione inversa vera Una seconda mutazione ripristina la sequenza di DNA originale. b) Mutazioni casuali Una seconda mutazione sullo stesso sito dà luogo ad un cambio di amino acido meno drammatico. Frequenza delle mutazioni Le mutazioni spontanee avvengono con una frequenza di circa 10-9 / basi / generazione I mutageni sono usati per incrementare la frequenza di mutazioni a ~10-6 to 10-7 / basi / generazione 9

10 Timina O H N CH 3 O N H Bromouracile O H N O N H Il Bromouracile viene incorporato nel DNA al posto della timina. Durante la replicazione del DNA, il bromouracile non appaia con l adenina e causa una mutazione puntiforme Br Agenti alchilanti Composti che modificano le basi del DNA chimicamente Durante la replicazione il DNA modificato non appaia causando una mutazione puntiforme. Esempio: dimetilsolfato Agenti intercalanti Si inseriscono tra le basi del DNA. Legami idrogeno Basi del DNA Agente intercalante (bromuro d etidio) Agenti intercalanti portano a piccole delezioni e inserzioni durante la replicazione del DNA. 10

11 Radiazioni Luce ultravioletta (UV) O O H CH 3 CH 3 N O N N H N O Dimeri di Timina: due "T sullo stesso filamento si legano in modo covalente. I dimeri di Timina portano ad errori nella replicazione. Trattamento dei batteri con un mutageno (produce mutazioni in siti random). Coltura mutagenizzata diluire e piastrare su un medium ricco Selezione o screening di ceppi mutanti che rechiedono istidina per crescere (His- phenotype). Piastra di replica Medium minimale senza istidina Medium minimale con istidina 11

12 5. Preparazione di colture per ceppi che richiedono istidina per crescere. 6. Questi ceppi hanno mutazioni su geni necessari per la biosintesi di istidina. 7. Si scrive una lista di ceppi mutanti per indicare il loro genotipo e fenotipo. Il genotipo e il fenotipo dei ceppi mutanti indica come differiscono dal ceppo wildtype. Strain # 1 2 genotype his-1 his-2 phenotype His- His- Si nominano i geni e le mutazioni (Ad esempio per un gene che sintetizza istidina) Gene hisc Geni mutanti hisc1, hisc2, hisc3 Proteina Fenotipi HisC or (name of protein) His+ (può produrre istidina) His- (non può produrre istidina 12