Analisi MLPA & Troubleshooting

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1 Analisi MLPA & Troubleshooting

2 - Fondata nel Focalizzata in precedenza sulla produzione di endonucleasi e marker molecolari - Dal 2002 tecnica MLPA : - ~400 probemix - Usate in tutto il mondo per le analisi di copy number e metilazione. - Certificazione ISO 13485: Obiettivo futuro: marchio CE

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5 Analisi dei raw data e troubleshooting

6 Tecnica relativa Le intensità assolute dei segnali non sono usate per l interpretazione! Ma Le probe ratio sono calcolate in base a: Sonde di riferimento che sono incluse nella maggior parte delle probemix; Campioni di riferimento che sono necessari per il confronto.

7 Confronto degli elettroferogrammi Campione di un paziente DMD Gain Ex 3-44 Campione di riferimento DMD normale

8 Confronto elettroferogrammi - sovrapposizione - Campione Reference: DMD normale Paziente: DMD Gain Ex 3-44

9 La variazione sperimentale può essere introdotta in ogni step

10 1. Set-up dell Esperimento

11 1.1 Trattamento dei campioni Il DNA di tutti i campioni deve essere trattato allo stesso modo per tutta la durata dell esperimento: Usare lo stesso metodo di estrazione per tutti i campioni e I reference. Usare DNA estratto dallo stesso tipo di tessuto. Usare concentrazioni simili per tutti i campioni.

12 1.2 Qualità dei campioni I risultati MLPA dipendono dalla qualità dei campioni: I contaminanti possono causare una denaturazione incompleta: - Sali e altri ioni I contaminanti possono causare sloping/pcr incompleta: - Ferro, etanolo, fenolo, Trizol, EDTA Uno stoccaggio per lunghi periodi e cicli ripetuti di congelamento e scongelamento potrebbero influenzare la qualità dei campioni.

13 1.3 Set-up dell Esperimento MLPA Uso di controlli e campioni di riferimento: Il controllo no DNA per controllare per contaminazioni di DNA genomico o prodotti MLPA. Campioni di riferimento per un analisi accurata. Controlli positivi possono aiutare nell interpretazione dei dati Aggiungere controlli in ogni nuovo esperimento MLPA! Con alcune probemix MLPA (ad es. P095) è altamente consigliato confrontare solamente i campioni dello stesso sesso.

14 1.3 Set-up dell Esperimento MLPA È raccomandato usare un numero di campioni di riferimento 1:7, con un minimo di 3 campioni di riferimento. Una distribuzione casuale dei campioni di riferimento permette una normalizzazione dei dati ottimale.

15 2. Esecuzione dell Esperimento

16 2.1 Raccomandazioni generali sul protocollo MLPA Seguire attentamente il protocollo, non usare volumi minori di probemix e di reagenti. Fare delle mastermix die reagenti (volumi grandi). Mescolare bene tutti i reagenti, ma non vortexare troppo a lungo. - Non vortexare mai gli enzimi! Gli enzimi sono viscosi, è quindi necessario pipettare lentamente oppure riscaldare (10 sec. tra le mani).

17 2.2 Reazione MLPA: Denaturazione ed ibridazione Non aspettare troppo a lungo dopo la denaturazione per continuare con l esperimento MLPA. Usare un termociclatore con un coperchio riscaldato per prevenire l evaporazione. Lo step di ibridazione dura 16 ore fino ad un massimo di 20 ore. Il buffer A di ligasi diventa meno stabile dopo ripetuti cicli di congelamento/scongelamento. Mescolare con attenzione. Assircurarsi che non ci siano bolle dopo l aggiunta della mix della ligasi ai campioni. Dopo il completamento i prodotti di ligazione possono essere conservati a 4⁰C.

18 3. Reazione MLPA

19 Raw Data Sono i dati che non sono manipolati (ad es. Size calling, correzione della baseline) dai software di analisi. Contengono la maggior parte delle informazioni che forniscono il metodo migliore per la valutazione dei picchi ed il troubleshooting. Possono essere accessibili attraverso i software di analisi di frammenti come Peakscanner, GeneMarker, Coffalyser.

20 Peak scanner

21 3. Problemi causati da errori durante la reazione di MLPA 3.1 Q-fragments alti 3.2 Denaturazione incompleta 3.3 Sloping del segnale 3.4 Alto picco dei primer

22 3.1 Q-fragments Alti Ogni probemix MLPA contiene 4 Q-fragments di nt. L amplificazione dei Q-fragments è indipendente dal DNA e dalla ligazione. I Q-fragments non dovrebbero essere alti più di 1/3 del D-fragment da 92 nt. Quando i Q-fragments sono alti: non è stato usato abbastanza DNA o la ligazione non è avvenuta con successo.

23 3.1 Q-fragments Alti Situazione normale con DNA sufficiente

24 3.1 Q-fragments Alti

25 3.1 Q-fragments Alti Non è stato usato sufficiente DNA o la ligazione non è avvenuta

26 3.1 Q-fragments Alti P Q T D - n o D N A - R B O. C 0 5 _ B N Dye Signal S i z e ( n t ) Controllo No DNA

27 3.1 Q-fragments Alti La quantità di DNA ottimale per l MLPA è di ng. La reazione di ligazione può non avvenire quando i campioni non sono depurinati nel sito di legame delle sonde MLPA. Almeno 5mM (preferibilmente 10mM) di Tris HCl con un ph tra 8.0 e 9.0 dovrebbe essere presente in 5µl DNA del campione prima di portarlo a 98 C per la denaturazione del DNA. Campioni di DNA eluiti in acqua sono vulnerabili. Se non siete certi del fatto che il campione di DNA sia in acqua o TE, è consigliato aggiungere 5 o 10 mm di Tris-HCl con un ph tra 8.0 e 9.0. Per esempio, per un campione di DNA 4µl aggiungere 1µl di 50mM Tris HCl ph 8.5.

28 3.2 Denaturazione incompleta La denaturazione è richiesta per il legame delle sonde MLPA

29 3.2 Denaturazione incompleta Sequenze ricche in CG hanno una Tm molto alta e sono difficili da denaturare. Sequenze particolari localizzate vicino a isole CpG sono soggette a denaturazione incompleta. Isole CpG sono spesso localizzate vicino (<5kb) al sito di inizio della trascrizione dei geni le sonde per l esone 1 sono le più coinvolte. La denaturazione incompleta può interferire con il legame delle sonde e potrebbe risultare in una falsa delezione.

30 3.2 Denaturazione incompleta I contaminanti influenzano la denaturazione: Sali, ad es. NaCl, KCl concentrazioni > 60mM creano problemi di denaturazione. Altri ioni, ad es. Fe, Mg A concentrazioni molto basse (1mM) questi ioni possono causare problemi di denaturazione.

31 3.2 Denaturazione incompleta Ogni kit MLPA contiene D-fragments a 88, 92nt e 96nt. I D-fragments a 88 e 96nt sono localizzati nelle isole CpG, che sono difficili da denaturare. Nel caso in cui il picco a 88 nt o a 96 nt fosse più basso (<40 %) del picco a D-fragment a 92 nt e della altre sonde, la denaturazione del campione è incompleta.

32 3.2 Denaturazione incompleta Campione con una corretta denaturazione P Q T C -1.5 u l.c 0 6 _ P F nt 96nt Dye Signal S ize (nt)

33 3.2 Denaturazione incompleta Denaturazione incompleta: riduzione dei segnali delle sonde P Q T C -8 0 m M s a lt.c 0 5 _ P nt 96nt Dye Signal S ize (nt)

34 3.2 Denaturazione incompleta Soluzioni: Usare una quantità minore di DNA: questo riduce la presenza di contaminanti che causano problemi di denaturazione. Procedere con uno step supplementare di purifica (come una semplice precipitazione con etanolo). Includere glicerolo (5% v/v concentrazione finale) in 5µl del campione di DNA

35 3.3 Sloping del Segnale Le intensità dei segnali dei frammenti MLPA più lunghi sono di 3 volte più basse di quelle dei frammenti più corti.

36 3.3 Sloping del Segnale Si possono identificare due tipi di sloping: 1) Sloping SOLO nei picchi MLPA e NON nel size standard: Causato durante la reazione di MLPA 2) Sloping SIA nei picchi MLPA SIA nel size standard: Causato durante la separazione dei frammenti (elettroforesi)

37 3.3 Sloping del Segnale Sloping solo nei picchi MLPA

38 3.3 Sloping del Segnale Sloping solo nei picchi MLPA Come risultato dello sloping, non è più possibile fare il size calling Segnali troppo bassi

39 3.3 Sloping del Segnale Sloping solo nei picchi MLPA La differenza di sloping tra i campioni di riferimento ed i campioni da testare può portare a conclusioni false Campione di riferimento Campione Test

40 3.3 Sloping del Segnale Sloping solo nei picchi MLPA Cause: 1) Contaminanti nel campione di DNA che inibiscono la polimerasi: Ad es. impurità ioniche come ferro (derivato da cellule del sangue o da biglie magnetiche) Etanolo, fenol o Trizol EDTA Soluzione: 1) Ridurre l influenza dei contaminanti usando una quantità minore di DNA (quantità ottimale: ng). 2) Effettuare uno step extra di purifica, come una semplice precipitazione con l etanolo.

41 3.3 Sloping del Segnale Sloping solo nei picchi MLPA Cause: 2) Eccessiva evaporazione durante la reazione MLPA: Soprattutto durante l ibridazione o quando si pipetta la reazione di ligazione; I tubi non chiusi perfettamente (ibridazione); Se si stanno manipolando grandi quantità di campioni (quando si pipetta la reazione di ligazione).

42 3.3 Sloping del Segnale Sloping solo nei picchi MLPA Cause: Soluzione: Controllare sempre che i tubi siano chiusi; Controllare se si sia verificata un evaporazione durante l ibridazione overnight aggiungendo un tubo con 8 μl di acqua. Il mattino seguente, dovrebbero rimanere almeno 5 μl di acqua sulla base del tubo. Evitare l evaporazione durante il pipettamento. Assicurarsi che i tubi non siano aperti per lungo tempo quando sono nel termociclatore a 54 C durante la preparazione della reazione di ligazione. Usare ad esempio pipette multicanale.

43 3.4 Alto picco di primer Picco dei primer Segnali ridotti dei picchi

44 3.4 Alto picco di primer Un alto picco di primer è indicativo di un fallimento della PCR. Un alto picco di primer spesso risulta in una riduzione dell altezza dei picchi. Non è più possibile calcolare la probe. Cause: Probemix non aggiunta; PCR fallita (ad. es. Polimerasi non attiva).

45 4)Separazione dei frammenti

46 4. Problemi causati durante la separazione dei frammenti 4.1 Sloping nei picchi MLPA e nel size standard 4.2 Intensità dei segnali MLPA non ottimale 4.3 Baseline Alta 4.4 Fluorescenza alta tra le sonde MLPA 4.5 I picchi del size standard non sono di altezze uguali

47 4.1 Sloping nei picchi MLPA e nel size standard Possono essere identificati due tipi di sloping: 1) Sloping SOLO nei picchi MLPA e NON nel size standard: Causato durante la reazione MLPA 2) Sloping in ENTRAMBI I picchi MLPA e nel size standard: Causato durante la separazione di frammenti

48 4.1 Sloping nei picchi MLPA e nel size standard Il GS500 size standard è progettato in modo tale che lo sloping possa essere facilmente identificato

49 4.1 Sloping nei picchi MLPA e nel size standard

50 4.1 Sloping nei picchi MLPA e nel size standard Cause: Polimero o capillari vecchi Injection voltage troppo alto Formammide di bassa qualità

51 4.2 Intensità del segnale dei picchi MLPA non ottimale Quando l intensità del segnale dei picchi MLPA va oltre il limite di rilevamento del sequenziatore, i picchi diventano troncati e non possono essere quantificati.i

52 4.2 Intensità del segnale dei picchi MLPA non ottimale I seguenti fattori influenzano l intensità del segnale: Concentrazione dei prodotti MLPA nell injection mixture Injection Voltage Injection Time

53 4.3 Baseline Alta Baseline: Intensità minima del segnale per dye Nessun campione passa il detector I Segnali dovrebbero essere 3 volte superiori alla baseline Cause: Finestra di detection non pulita perfettamente Matrice di calibrazione non ottimale

54 4.4 Fluorescenza alta tra sonde MLPA Il punto più basso tra 2 sonde MLPA dovrebbe essere inferiore a 250 unità. Usare meno prodotto PCR: - Diluire i prodotti PCR - Cambiare le impostazioni di injection

55 4.5 I picchi del size standard non sono di altezze uguali Una quantità eccessiva di prodotto PCR nell injection mixture può risultare in una concentrazione alta di sali: Re-annealing dei prodotti PCR segnali diversi o perdita di segnali inattesi. Normale Re-annealing

56 4.5 I picchi del size standard non sono di altezze uguali Suggerimenti: Non correre i prodotti PCR in acqua, ma in formammide HiDi Non usare il prodotto PCR a più di 1/10 del volume finale dell injection mixture. Molti problemi sono spesso risolti diluendo i prodotti PCR. Controllare il sistema di elettroforesi capillare (ad. es. polimero, scarti, tubi, vassoio ed il laser, la temperatura), sostituire il buffer e l acqua e far ripartire le run fallite.