USO DEI MARCATORI MOLECOLARI A DNA PER LA TRACCIABILITÀ DEI VITIGNI NEI VINI

Transcript

1 USO DEI MARCATORI MOLECOLARI A DNA PER LA TRACCIABILITÀ DEI VITIGNI NEI VINI CLAUDIO D ONOFRIO*, FABIOLA MATESE*, ELEONORA DUCCI E GIUSEPPE CELANO *UNIVERSITÀ DI PISA, DIPARTIMENTO DI SCIENZE AGRARIE, ALIMENTARI E AGRO-AMBIENTALI, UNIVERSITÀ DELLA BASILICATA, DIPARTIMENTO DELLE CULTURE EUROPEE MEDITERRANEE (DICEM)

2 INTRODUZIONE La tracciabilità dei prodotti alimentari è particolarmente importante per la tutela del consumatore e dell attività delle imprese. Per la tracciabilità delle produzioni viti-vinicole, una delle più redditizie attività agricole, assumono un importanza fondamentale le tecniche di biologia molecolare, che comprendono anche l utilizzo di marcatori molecolari a DNA. In viticoltura i marcaroti molecolari a DNA al momento maggiormente utilizzati per l identificazione dei vitigni (genotipizzazione) sono i microsatelliti. I marcatori molecolari a DNA possono consentire l identificazione delle matrici vegetali contenute negli alimenti e nei prodotti della filiera agroalimentare. La genotipizzazione di matrici complesse come il vino, e quindi l identificazione dei vitigni utilizzati per la produzione del vino, rappresenta un importante strumento per controllare l autenticità delle uve utilizzate nel processo di produzione. La presente attività ha avuto l obbietto di definire una metodologia efficace per la tracciabilità del vino Aglianicone in purezza utilizzando l analisi del polimorfismo dei microsatelliti. fig. 1 Esempio di quantizzazione del DNA tramite PCR real-time fig. 2 Quantizzazione DNA negli estratti di pellet 94

3 ESTRAZIONE DNA DA MOSTI Nell ambito del progetto Aglianicone sono stati effettuati esperimenti per lo sviluppo di un adeguato protocollo di estrazione del DNA dai mosti e dai vini, e quindi di un protocollo in grado di recuperare dal vino il DNA, soggetto a continua degradazione e precipitazione durante la fase di vinificazione e di evoluzione del vino, di quantità e qualità adeguata per l amplificazione dei microsatelliti tramite la reazione di PCR (Polymerase Chain Reaction): è particolarmente importante che il DNA estratto sia libero da contaminazioni di polisaccaridi, tannini e polifenoli presenti nella matrice vinosa che sono forti inibitori della reazione di PCR. Le prove preliminari che sono state effettuate sulla base delle informazioni riportate in bibliografia. Negli ultimi anni alcuni autori (Siret et al, 2000; Faria et al, 2000; Garcia-Beneytez et al, 2002; Rodriguez-Plaza et al, 2006) hanno cercato di mettere a punto adeguati protocolli di estrazione del DNA dal vino, sul cui DNA sono stati amplificati microsatelliti cloroplastici (Baleiras.Couto et al, 2006). In questi lavori la quantificazione del DNA di vite estratto da vino è stata effettuata utilizzando la PCR real-time (Dràbek et al, 2008, Savazzini et al, 2006), una tecnica che permette di rilevare quantità di DNA nell ordine di ng per litro, e, inoltre, è stata evidenziata una possibile relazione tra la proporzione di ciascuna varietà presente nella miscela del vino e l intensità del segnale degli alleli microsatellite rilevata con un sequenziatore automatico e con metodi fluorimetrici (Baleiras.Couto et al, 2006). Nel presente progetto sono stati presi in considerazione principalmente i protocolli di Savazzini et al., 2006 e Siret et al., 2000 che sono stati testati separatamente su pellet e surnatante di mosto e vino. La quantificazione del DNA estratto è stata effettuata amplificando 2 geni specie- specifici, Vvnced2 (nine-cisepoxycarotenoiddioxigenase2) e resveratrolo-sintasi, tramite PCR real-time, in modo da distinguere il DNA di vite da quello di lieviti e batteri implicati nel processo di vinificazione. Test preliminari, effettuati su campioni di DNA estratto da giovani foglioline di Sangiovese (clone CCL 2000/1), hanno confermato la specificità di tali primers ed hanno permesso di mettere a punto una retta di taratura poi utilizzata per la quantificazione dei DNA di vite estratto dai campioni di mosto e di vino (figura 1). In particolare, ottimi risultati sono stati ottenuti utilizzando i primers che amplificano il gene che codifica per il resveratrolo- sintasi. l protocollo di estrazione del DNA che al momento attuale ci ha dato migliori risultati è quello descritto da Siret et al (2000) opportunamente modificato nell ambito del presente progetto. L estrazione del DNA è stata effettuata su 4 campioni ottenuti da un vigneto Aglianicone di Monteforte oggetto dell azione di trasferimento del presente progetto, e volutamente contaminati con Sangiovese e Fortana, sporadicamente presente nei vigneti dell area di coltivazione oggetto del presente progetto. I campioni utilizzati erano costituiti da: 1. campione 1: mostro prima della fermentazione; 2. campione 2: mosto prima della fermentazione 3. campione 3: mosto in fermentazione nel mastello; 4. campione 3: vino a fine fermentazione; Per separare le parti solide (pellet) dalla soluzione acquosa (surnatante), 50 ml di ciascun campione sono stati centrifugati a 5000g per 60 minuti a 4 C. Il surnatante è stato trasferito in un nuovo tubo mentre il pellet è stato conservato a -20 C fino all utilizzo. Un volume di isopropanolo freddo (20 C) è stato aggiunto ai surnatanti in presenza di sodio acetato 0.3M e il campione è stato incubato overnight a -20 C per precipitare gli acidi nucleici. Il DNA è stato precipitato mediante centrifugazione a 5000 g per 30 minuti a 4 C. Gli acidi nucleici ottenuti dai pellet (1P, 95

4 2P, 3P, 4P) e dai surnatanti (1S, 2S, 3S, 4S) dei campioni sono stati risospesi in 4 ml di TEX buffer. Un volume di cloroformio/alcol isoamilico (24:1) è stato aggiunto ai campioni. Dopo una centrifugazione a 5000 g per 10 minuti a temperatura ambiente, la fase acquosa è stata trasferita in un nuovo tubo, è stato aggiunto 1/10 di volume di CTAB 10% ed è stata eseguita una seconda estrazione cloroformio/alcol isoamilico. 2 volumi di etanolo freddo (-20 C) sono stati aggiunti ai campioni che sono stati miscelati invertendo i tubi 2-4 volte e incubati a -20 C overnight. Il DNA è stato poi precipitato mediante centrifugazione a 5000 g per 30 minuti e risospeso in 200 µl di TE. I DNA ottenuti dal pellet e dal surnatante dei campioni sono stati fatti correre su gel di agarosio ad alta risoluzione colorato con Bromuro di Etidio per verificare la qualità e la quantità del DNA attraverso visualizzazione con raggi UV (302 nm). Dal gel (figura 2) è stato possibile osservare la presenza del DNA negli estratti di pellet: poiché soprattutto nel mosto durante e dopo la fermentazione sono presenti anche lieviti e batteri necessari per il processo di vinificazione, in ciascun campione è stato amplificato in PCR real-time il gene specie-specifico che codifica per il resveratrolo sintasi al fine di verificare l esatta quantità del DNA di vite in ciascun estratto. La mix per la reazione di amplificazione utilizzata per la quantizzazione consiste in 1x Eva Green Master Mix Biorad, 0,3 µm di ciascun primer e l estratto ottenuto dai pellet e dai surnatanti di ciascun campione. Il protocollo di amplificazione utilizzato è: un iniziale step di denaturazione a 95 C per 2 minuti, seguito da 50 cicli di amplificazione consistenti in denaturazione a 94 C per 15 secondi, annealing a 58 C per 1 minuto ed estensione a 72 C per 1 minuto. L amplificazione è seguita da una curva di melting per controllare la specificità dell amplificato. Il gene per il resveratrolo sintasi si è amplificato solo nei campioni derivati da pellet, quindi è stato confermato ciò che è possibile osservare nel gel e cioè che nel surnatante l estrazione del DNA non è andata a buon fine. Con il protocollo di estrazione utilizzato è stata ottenuta una quantità di DNA di vite di 210 ug/l e 148 ug/l rispettivamente dei pellet dei 2 campioni di mosto prima dell inizio della fermentazione, 81 ug/l nel pellet del campione di mosto in fermentazione nel mastello, e 0,3 ug/l dal pellet del campione di vino a fine fermentazione. 96

5 GENOTIPIZZAZIONE DEI MOSTI ATTRAVERSO L ANALISI DEL POLIMORFISMO DEI MICROSATELLITI Per la genotipizzazione dei 4 campioni sono stati amplificati tutti i 9 loci del profilo microsatellite di riferimento a livello internazionale. Per ogni locus è stato amplificato un numero di alleli compreso tra 3 e 5 (tabella 1) la cui combinazione ha permesso di identificare i 3 vitigni utilizzati in uvaggio per ottenere il vino analizzato (tabella 2) VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD tab. 1 Alleli SSR amplificati dai DNA estratti da mosto e vino VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79 VVMD25 VVMD28 VVMD tab. 2 Vitigni identificati per mezzo dell analisi del DNA estratto dal vino. Aglianicone Sangiovese Fortana alleli comuni 97