Strategie per la purificazione delle proteine

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1 Strategie per la purificazione delle proteine

2 In una cellula ci possono essere molte proteine (ad esempio, ci sono circa 4300 geni in E. coli) Una singola proteina può rappresentare una frazione tra lo % delle proteine totali Inoltre ci sono altri componenti: Acidi nucleici, carboidrati, lipidi, piccole molecole Le proteine possono essere trovate in diversi stati solubili, (insolubili -native o aggregate, inclusion bodies, integrate o associate alle membrane oppure in associazione con il DNA) ed in diverse localizzazioni (compartimenti subcellulari)

3 Principi per la purificazione delle proteine Definire gli obiettivi (scopi accademici o applicazioni industriali) Purezza, attività e quantità di prodotto finale richiesto (possibilità di produzione di proteine ricombinanti) Definire le proprietà della proteina di interesse ed eventualmente delle impurezze critiche (purezza elevata o estratto grezzo, se meno contaminanti più facile isolarla): ricorda che la purezza assoluta è un concetto astratto! Sviluppare saggi analitici È necessario identificare la proteina nel corso della purificazione (info su peso molecolare, pi, ) Rimuovere rapidamente i contaminanti capaci di danneggiare la proteina (proteasi)

4 Perchè purificare una proteina? Applicazioni industriali o farmacologiche Studi strutturali e/o funzionali Per produrre anticorpi Sequenza parziale La potenziale applicazione influenzerà l uso delle tecniche impiegate

5 Domande iniziali Quanta e quanto pura? (scelta del metodo per verificare la purezza) applicazione sorgente fattibilità Configurazione nativa? Studi struttura/funzione (si) microsequenza (no) anticorpi (forse) Metodi di identificazione? Saggi funzionali (ad esempio enzimatici) Saggi immunologici SDS-PAGE

6 Capacità: volume di miscela che può essere purificata Risoluzione: purezza della della proteina target Resa: % di proteina target che può essere recuperata (rispetto al quantitativo iniziale della stessa proteina) Velocità: è fondamentale soprattutto nei primi step (rimozione delle proteasi)

7 Principi generali per la purificazione delle proteine (rese elevate con minor numero di passaggi possibilecompromesso purezza-resa) Usare una tecnica diverse in ciascun passaggio Per avvantaggiarsi delle diverse proprietà della proteina (dimensione, carica, idrofobicità, eventuale specificità per ligandi) Minimizzare la manipolazione del campione ad ogni stadio Minimizzare l uso di additivi Minimizzare il numero di passaggi

8 Usare una tecnica diverse in ciascun passaggio Per avvantaggiarsi delle diverse proprietà della proteina (dimensione, carica, idrofobicità, eventuale specificità per ligandi) Minimizzare la manipolazione del campione ad ogni stadio Il materiale che si ottiene ad un passaggio deve essere nelle condizioni ph e forza ionica ideali per il passaggio successivo Minimizzare l uso di additivi Minimizzare il numero di passaggi Principi generali per la purificazione delle proteine

9 Principi generali per la purificazione delle proteine Usare una tecnica diverse in ciascun passaggio Per avvantaggiarsi delle diverse proprietà della proteina (dimensione, carica, idrofobicità, eventuale specificità per ligandi) Minimizzare la manipolazione del campione ad ogni stadio Minimizzare l uso di additivi (mantenimento dell attività biologica) Minimizzare il numero di passaggi

10 Principi generali per la purificazione delle proteine Usare una tecnica diverse in ciascun passaggio Per avvantaggiarsi delle diverse proprietà della proteina (dimensione, carica, idrofobicità, eventuale specificità per ligandi) Minimizzare la manipolazione del campione ad ogni stadio Minimizzare l uso di additivi Minimizzare il numero di passaggi (per non diminuire la resa) Ad ogni passaggio: analisi elettroforetiche

11 Es: purificazione di GGT1 Gamma glutamiltranspeptidasi 1 (enzima che taglia il legame g-glutamilico del glutatione extracellulare)

12 Ad esempio: La resa di una proteina ottenuta dopo 4 passaggi di purificazione, ciascuno caratterizzato da una perdita del 25% del prodotto, è pari al 32% 0.75 x 0.75 x 0.75 x 0.75 = (31.6%)

13 Sviluppare uno schema per la purificazione Condurre esperimenti su scala pilota per valutare l efficacia di varie tecniche di separazione Iniziare con tecniche rapide ad alta capacità (generalmente a bassa risoluzione), e proseguire con tecniche ad alta risoluzione e bassa capacità

14 La purificazione delle proteine è un processo complesso che generalmente richiede diversi passaggi Campione Tecnica separativa Frazionamento Saggi analitici Ripetere la separazione con una nuova tecnica, fino alla purificazione finale N o eliminare N o C è attività si Unire le frazioni Controllare la purezza Pura? Si Tecnica analitica

15 Prima di iniziare la purificazione è opportuno definire un saggio di identificazione della proteina a) Enzimatico. Poiché il controllo può essere ripetuto molte volte sarebbe utile disporre di un saggio semplice ed economico. Generalmente un attività enzimatica può essere controllata tramite cambiamenti in assorbanza che possono essere misurati con uno spettrofotometro. b) Immunologico. Attraverso l uso di anticorpi specifici c) Peso molecolare. Tramite SDS-PAGE d) Spettrofotometrico. Se la proteina possiede particolari cromofori

16 Capacità vs. Risoluzione Metodo capacità risoluzione tempo (e sforzo) Solubilità differenziale Scambio ionico Gel filtrazione Elettroforesi HPLC/FPLC Affinità dipende dai ligandi

17 Metodi di frazionamento preliminare a bassa risoluzione (I) Frazionamento con Sali (Salting out). il genere si usa solfato di ammonio. Fa precipitare le proteine senza denaturarle. L aggiunta di sale rimuove le molecole d acqua sulla superficie della proteina, permettendone l aggregazione e quindi la precipitazione. Le proteine molto idrofobiche precipitano a bassa concentrazione, quelle meno idrofobiche precipitano ad alta concentrazione di sale. Tutti i passaggi sono generalmente condotti a 4 C. Ogni data proteina precipita (effetto salting out) in un ristretto intervallo di solfato di ammonio.

18 La solubilità delle proteine è fortemente influenzata dalla forza ionica

19 Principio del salting out : 1. gli ioni di sale aggiunto competono con gli ioni presenti nella soluzione per le molecole di solvente, facilitando l aggregazione proteica; 2. Proteine diverse precipitano a diverse concentrazioni di sale. 100% 100% [(NH 4 ) 2 SO 4 ] solubilità 0% 0%

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21 Metodi di frazionamento preliminare a bassa risoluzione (II) Precipitazione al calore. Il calore denatura le proteine che perdono la loro struttura terziaria, esponendo residui idrofobici sepolti nello stato nativo nel core proteico e causando la formazione di aggregati. Si stabilisce su un piccolo campione la temperatura a cui la proteina di interesse denatura. Si scalda la miscela ad una temperatura 5-10 C inferiore a quella critica per un tempo adeguato (15-30 minuti). Le proteine denaturate sono rimosse per centrifugazione.

22 Metodi di frazionamento preliminare a bassa risoluzione (III) Precipitazioni con solventi organici si basa sulla diversa solubilità delle diverse proteine in soluzioni acquose di solventi organici (soprattutto alcoli). Il processo è spesso condotto a 20 C per evitare la denaturazione. Precipitazione al punto isoelettrico. Le proteine possono essere cariche positivamente o negativamente e possono essere neutre per una eguaglianza di cariche; quando la carica netta è nulla le proteine si trovano nelle condizioni migliori per formare aggregati fra loro.

23 Metodi di frazionamento successivi:

24 Gel filtrazione

25 Cromatografia a scambio ionico

26 Cromatografia di affinità

27 Come identificare le frazioni che contengono proteine Frazioni # A A Peaks Le proteine totali vengono stimate registrando l assorbanza a 280 nm con uno spettrofotometro. I valori ottenuti possono essere utilizati per costruire un grafico che è chiamato profilo di eluizione. Fraction #

28 Il primo passaggio di purificazione cromatografica deve rimuovere la maggior parte dei contaminanti (scambio ionico/gel filtrazione?) I passaggi intermedi sfruttano proprietà differenti (le tecniche di assorbimento consentono di recuperare il campione in piccoli volumi) Il passaggio finale deve rimuovere gli ultimi contaminanti La proteina viene infine dializzata e concentrata

29 Metodi per la concentrazione precipitazione (NH 4 ) 2 SO 4 dialisi contro 50% glicerolo dialisi contro PEG ultrafiltrazione liofilizzazione cromatografia

30 Come valutare la procedura di purificazione quantità recupero (resa %) livello di purificazione

31 Attività specifica = unità totali di enzima quantita di proteine totali Livello di purificazione = attività spec. recuperata/mg attività spec. iniziale/mg Resa % = quantità di proteina purificata quantità di proteina nell estratto iniziale

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