Analisi e purificazione di proteine

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1 Analisi e purificazione di proteine elettroforesi ultracentrifugazione cromatografia frammenti specifici sequenziamento struttura primaria livelli superiori contesto fisiologico funzione

2 Condizioni denaturanti La miscela di proteine viene disciolta in: Sodio Dodecil Solfato (SDS) * + mercaptoetanolo [HS-CH 2 -CH 2 -OH]** 1 SDS / 2 residui amino acidici si legano alla catena principale carica negativa netta massa della proteina carica proteina-sds>>carica proteina nativa *Detergente anionico che spezza i legami non covalenti ** Riduce i ponti disolfuro

3 Figure 8-17 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

4 Figure 8-18a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

5 Elettroforesi su gel di poliacrilamide i gel di poliacrilamide sono chimicamente inerti varie dimensioni dei pori setaccio molecolare migliora l efficienza dell elettroforesi

6 Forza di trascinamento: carica lunghezza, ma anche inversamente proporzionale alla massa (che è lunghezza) I due effetti in una soluzione libera si compenserebbero gel filtrante Figure 8-18b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

7 Figure 8-19 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

8 colorazione con argento o con blu Coomassie 1 dalton = 1/12 massa del 12 C = Kg amu : unità di massa atomica = massa del protone 1 amu = 1, Kg

9 Sensibilità del metodo Blu Coomassie bande contenenti 0.1 mg di proteina argento bande contenenti 0.02 mg di proteina Si possono distinguere proteine che differiscono in massa di circa il 2% A: 40 kd circa 10 residui di differenza B: 41 kd

10 Focalizzazione isoelettrica pi = punto Isolelettrico = ph a cui la carica netta è zero citocromo C pi = 10.6 albumina pi = 4.8 elettroforesi in gradiente di ph (senza SDS)

11 focalizzazione isoelettrica + elettroforesi su gel con SDS 1. focalizzazione isoelettrica elettroforesi 2. gel con SDS elettroforesi macchie su 2 dimensioni Proteine di E.coli sono state separate > 1000 proteine in un singolo esperimento pi

12 Figure 8-23 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

13 Purificazione di proteine nella loro forma nativa (struttura 3D intatta) si sfruttano 1. dimensioni 2. carica 3. affinità con molecole specifiche 4. massa test per l attività catalitica test per la purezza (SDS)

14 1. Separazione mediante dialisi separazione delle proteine da molecole molto più piccole

15 insolubile, ma altamente idratato 1. Gel-cromatografia = cromatografia per filtrazione su gel le molecole più piccole entrano nei granuli e le grandi no le grandi passano più velocemente

16 raccogliendo in tempi diversi all uscita della colonna si possono separare proteine di dimensioni diverse e con diversa solubilità

17 2. Cromatografia a scambio ionico ph=7 carica netta positiva attacco a COO - carica netta negativa nessuna interazione

18 3. Cromatografia di affinità esempio: Concanavalina A alta affinità per il glucosio colonna con glucosio la proteina si attacca il resto scorre aggiunta di glucosio liberazione della proteina colonna G G aggiunta glucosio colonna G G

19 4. Ultra-centrifugazione refrigerazione campione sedimentato vuoto motore

20 F 2 2 c m r m1 v r v : volume specifico della proteina :densità della soluzione v f Fc f velocità di m :coeff. 1 v f sedimen. 2 r costante frizionale della proteina fattore di galleggiamento s v coeff. di sediment. 2 r m 1 f v [s] = Svedberg (S) 1S = sec

21 Velocità di sedimentazione massa (a parità di forma e densità) (densità della molecola) -1 funzione (complicata) della forma (f ) funzione della densità della soluzione ( ) v 1 v 1 v 1 galleggiamento immobilità affondamento

22 La centrifugazione può essere usata per separare molecole con diversi coefficienti di sedimentazione S

23 Esempio Molecola anticorpale: Ultracentrifuga: Accelerazione centrifuga: PM = 150 kd r = 8 cm, rivoluzioni/ min (rpm) 4.9 x 10 8 cm/s 2 5 x 10 5 g se v (proteina) = 3.4 x 10-4 cm/s allora s = 7S

24 concentrazione aa Sequenziamento per mezzo della degradazione di Edman i. composizione in a.a. Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly scaldando a 110ºC in HCl 6N per 24 ore Asp: catena laterale acida: primo aa ad uscire si può individuare fino a 1 mg di un aa (=quantità presente in un impronta digitale) cromatografia a scambio ionico eluzione in funzione del ph

25 ii. identificazione del residuo amino terminale (a) marcatura con cloruro di dansile idrolisi (b) degradazione di Edman: rimozione di un a.a. alla volta dall estremità amino-terminale

26 Passi del sequenziamento a. composizione in a.a. 1Ala, 2Gly, 1Asp, 1Phe, 1Arg b. rimozione alla Edman c. composizione in a.a. 2Gly, 1Asp, 1Phe, 1Arg d. rimozione alla Edman e. composizione in a.a. 1Gly, 1Asp, 1Phe, 1Arg f. e così via a-c Ala c-e Gly e così via

27 Metodo di Edman Lunghezza massima 50 resisui perdita di attendibilità Tagli specifici con metodi chimici o enzimatici Reagente Taglio chimico Bromuro di cianogeno O-iodobenzoato Idrossilamina 2-Nitro-5-tiocianobenzoato Taglio enzimatico Tripsina Clostripaina Proteasi dello Stafilococco Sito di taglio Lato carbossilico di residui Met Lato carbossilico di residui Trp Legami Asp-Gly Lato aminico di residui di Cis Lato carbossilico di residui Lys e Arg Lato carbossilico di residui Arg Lato carbossilico di residui Asn e Gln

28 Prima proteina sequenziata Sanger F., Tuppy H. (1951) The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin 2. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates. Biochem. J. 49: Si dimostró che la sequenza era costituita solo da L-aminoacidi uniti tra loro da legami peptidici fra i gruppi a-aminici e i gruppi a-carbossilici metodo costoso ed inefficiente DNA ricombinante