V R V t. Proteine ad alto peso molecolare. Proteine a peso molecolare intermedio. Proteine a basso peso molecolare. Kd + piccolo.

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1 V 0 Proteine ad alto peso molecolare Proteine a peso molecolare intermedio V R V t Proteine a basso peso molecolare Kd elevato Kd piccolo

2 Esclusione molecolare o gelfiltrazione = Volume totale V T = V 0 V i V i = Volume interno delle sferette V 0 = Volume vuoto o interstiziale Ogni analita eluirà dalla colonna con un suo V e (volume di eluizione) e in base al suo coefficiente di ripartizione Kd V e = V 0 Kd V i Se la proteina percorre sia l interno delle sferette sia gli spazi esterni Ve = intermedio fra V 0 e V T

3 FASI STAZIONARIE: sono commercialmente disponibili diversi tipi gel polimerici, si differenziano per il LIMITE DI ESCLUSIONE e l INTERVALLO o CAMPO DI FRAZIONAMENTO Nome commerciale Materiale Campo di frazionamento (Da) Sephadex G10 Destrano Sephadex G25 Destrano Sephadex G50 Destrano Sephadex G100 Destrano Sephadex G200 Destrano BioGel P2 Poliacrilammide BioGel P6 Poliacrilammide BioGel P10 Poliacrilammide BioGel P30 Poliacrilammide BioGel P100 Poliacrilammide BioGel P300 Poliacrilammide Sepharose 6B Agarosio Sepharose 4B Agarosio Sepharose 2B Agarosio

4 Sephadex G200; range di frazionamento Da Miscela di analiti caricata in colonna: Fase mobile: fosfato di sodio 0.05 M NaCl 0.15 M, ph 7.0 Ferritina Transferrin Vit. B12 Tiroglobulin IgG Ovalbumin Mb

5 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO SI BASA SULLA INTERAZIONE ELETTROSTATICA FRA MOLECOLE CON CARICA DI SEGNO OPPOSTO SFRUTTA LE DIVERSE PROPRIETA ACIDOBASE DELLE PROTEINE E QUINDI IL LORO DIVERSO STATO DI IONIZZAZIONE AL VARIARE DEL ph FASI STAZIONARIE: sono resine scambiatrici di IONI

6 PRINCIPALI FASI STAZIONARIE USATE IN CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Scambiatori DEBOLI: sono ionizzati in un intervallo ristretto di ph (dipende dal pka dei gruppi dissociabili) Scambiatori FORTI: sono ionizzati in un ampio intervallo di ph (sono utilizzabili praticamente a qualunque ph) Scambiatore CATIONICO DEBOLE 4<pKa <6 Scambiatore CATIONICO FORTE pka < 1 Scambiatore ANIONICO DEBOLE 8 <pka <10 Scambiatore ANIONICO FORTE pka > 13 MATRICE Agarosio Cellulosa Destrano Poliacrilato Cellulosa Destrano Polistirene Agarosio Cellulosa Destrano Polistirene Cellulosa Destrano Polistirene GRUPPO FUNZIONALE CARBOSSILE COO CARBOSSIMETILE CH 2 COO SULFONATO SO 3 SULFOMETILE CH 2 SO 3 SULFOPROPILE CH 2 CH 2 CH 2 SO 3 AMMINOETILE (CH 2 ) 2 NH 3 DIETILAMMINOETILE (CH 2 ) 2 NH(CH 2 CH 3 ) 2 TRIMETILAMMINOMETILE CH 2 N (CH 3 ) 3 TRIETILAMMINOETILE CH 2 CH 2 N (CH 2 CH 3 ) 3

7 Per separare e purificare proteine stabili a ph superiori al loro pi: Scambio anionico A ph maggiore del pi (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la resina scambiatrice di anioni. L eluizione avviene con [Cl ] crescente o abbassando il ph (più difficile da controllare). Per separare e purificare proteine stabili a ph inferiori al loro pi: Scambio cationico A ph minore del pi (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e lega la resina scambiatrice di cationi. L eluizione avviene con [Na ] crescente o aumentando il ph. Per separare e purificare proteine stabili in un ampio intervallo di ph: potrò usare entrambi gli scambiatori (anionico o cationico) Che tipo di cromatografia a scambio ionico utilizzare dipende soprattutto da: 1) pi delle proteine da separare 2) stabilità delle proteine d interesse, in genere stabili in un ristretto range di ph

8 CROMATOGRAFIA a SCAMBIO IONICO ANIONICO (RESINA CARICA POSITIVAMENTE) Proteina cariche negativamente Proteina cariche positivamente (non interagiscono) Proteina cariche negativamente e Na Proteina cariche positivamente

9 SCAMBIATORI DI ANIONI Gruppo DIETILAMMINOETILICO (DEAE) H 9.0 (CH 2 ) 2 NH(CH 2 CH 3 ) 2 Resina ionizzata positivamente sino a ph 89 Gruppo TRIMETILAMMINOMETILICO CH 2 N (CH 3 ) 3

10 Cromatografia a scambio anionico con SCAMBIATORE FORTE Resina = Trimetilamminoetil cellulosa Gruppo TRIMETILAMMINOMETILICO Cellulosa CH 2 N (CH 3 ) 3 Resina ionizzata positivamente sino a ph 13 Utile a qualunque ph si voglia lavorare Fase mobile = deve avere un ph > pi della maggior parte delle proteine presenti in miscela. Inizialmente la fase mobile avrà BASSA FORZA IONICA Il campione = miscela di proteine da separare solubilizzate nello stesso tampone utilizzato per equilibrare la fase stazionaria. Le proteine cariche negativamente scambieranno con il loro controione e si legheranno alla fase stazionaria con una forza direttamente proporzionale alla loro intensità di carica. Le proteine cariche positivamente invece non interagiscono con la resina e saranno eluite per prime al tempo (o volume) morto di eluizione.

11 Eluizione NON ISOCRATICA (a step o in gradiente): Diminuzione ph le proteine iniziano a protonarsi, si caricano positivamente e si staccano dalla fase stazionaria e eluiscono. Aumento forza ionica scambio per azione di massa p.es con un aumento della concentrazione di Na Cl (si modifica la concetrazione del controione Cl che compete con le proteine negative) ELUIZIONE A STEP O A GRADIENTE Soluzioni eluenti a concentrazione crescente di NaCl Variazione continua e lineare della concentrazione del controione

12 Cromatografia a SCAMBIO ANIONICO DEBOLE: ad esempio DEAEcellulosa Resina = Dietil aminoetilcellulosa: In quali condizioni la Fase stazionaria ha carica? pka = 9.0 per ph = pka = ph % gruppi protonati 50% gruppi deprotonati ph = pka 1 90% dei gruppi funzionali è protonato ph = pka 2 99% dei gruppi funzionali è protonato FASE MOBILE = DEVE ESSERE UN TAMPONE CON UN PH 8.0 ph 8.0 = è un buon compromesso: a ph 8.0 un buon numero di proteine sono cariche negativamente e la DEAEcellulosa ha un buon grado di protonazione. Posso provare a separare proteine presenti in miscela anche non conoscendo i loro pi. Eluizione (a step o in gradiente) = Aumento forza ionica i controioni Cl si scambiano con le proteine per azione di massa e favoriscono la loro eluizione. Diminuzione ph la DEAEcellulosa rimane carica positivamente, le proteine che erano negative si protonano via via che il ph diminuisce.

13 SCAMBIO CATIONICO FORTE Gruppo SULFONICO Cellulosa SO 3 Lega proteine cariche positivamente Sempre ionizzata a qualunque valore di ph. Ho una grande libertà nella scelta del ph della fase mobile, dipende solo dalla stabilità delle mie proteine d interesse. FASE MOBILE = soluzione tampone a bassa forza ionica con un ph < pi della maggior parte delle proteine (se conosco i loro pi) presenti in miscela nel campione, altrimenti uso un ph di compromesso (tra 5 e 6 per es.) Eluizione NON ISOCRATICA (a step o in gradiente): AUMENTO del ph le proteine si deprotonano, raggiungono il loro pi o diventano cariche negativamente. Si staccano dalla fase stazionaria e eluiscono. Aumento forza ionica l aumento di concentrazione dei controioni Na consentono il distacco delle proteine legate per effetto di competizione

14 CAMBIO CATIONICO DEBOLE Resina = CMcellulosa: carbossimetil cellulosa A quali valori di ph il gruppo carbossilico è ionizzato? COOH COO H pka 5.0 Se ph = pka= % gruppi sono protonati 50% dei gruppi deprotonati ph = pka 1 = 6.0 % deprotonaz = 90% ph = pka 2 = 7.0 % deprotonaz = 99% FASE MOBILE = DEVE ESSERE UN TAMPONE CON UN PH 6.0 ph 6.0 = è un buon compromesso. A ph 6.0 un buon numero di proteine sono cariche positivamente e la CMcellulosa ha un buon grado di deprotonazione Eluizione NON ISOCRATICA (a step o in gradiente): AUMENTO del ph le proteine si deprotonano, raggiungono il loro pi o si caricano negativamente. Si staccano dalla fase stazionaria e eluiscono. Aumento forza ionica l aumento di concentrazione dei controioni Na consentono il distacco delle proteine legate grazie ad un effetto di competizione

15 Pianificare la separazione delle seguenti proteine utilizzando una colonna cromatografica contenente lo scambiatore di cationi CMcellulosa. A quale valore di ph dobbiamo equilibrare la FS? Stabilire la carica di ciascuna proteina nelle condizioni prescelte pi Emoglobina 7,1 Citocromo c 10,6 Fibrinogeno 5,8 Ribonucleasi 7,8 Lisozima 11,0 carica (ph < pi) (ph < pi) 0/ (ph pi) (ph < pi) (ph < pi) In quali condizioni sperimentali possiamo eluire le proteine?. Ipotizzare il grafico di eluizione corrispondente

16 Scegliere le condizioni sperimentali più opportune per purificare le seguenti proteine a partire da una miscela contenente: pi PM (kda) Emoglobina Albumina Ribonucleasi Lisozima Insulina Citocromo c Quale tipo o tipi di cromatografia si possono utilizzare? In quali condizioni sperimentali si deve lavorare? Indicare le condizioni iniziali e quelle di eluizione Ipotizzare il grafico di eluizione corrispondente