CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC)

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1 CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) La fase stazionaria riveste con uno strato sottile una lastrina di vetro o alluminio La lastrina viene disposta verticalmente in un recipiente chiuso ermeticamente detto camera di eluizione (becker coperto, camera cromatografica), contenente dell eluente che bagna solo la parte inferiore della lastrina (al di sotto della linea di deposizione). La fase mobile si muove dal basso verso l alto per capillarità. Quando l'eluente raggiunge quasi l estremità della lastrina, la si rimuove dalla camera di eluizione e la si sviluppa per evidenziare delle macchie. La TLC è molto utile per seguire l andamento di una reazione, per saggiare la purezza di un composto e per identificare un prodotto noto in una miscela. Agli analiti si associa il fattore di ritardo R f costante per ciscun composto dato dal : R f = spostamento della sostanza spostamento del fronte del solvente

2 Visualizzazione dei risultati Nel caso le macchie non siano colorate, è possibile ricorrere a diversi metodi per visualizzare il risultato della separazione: se gli analiti sono composti aromatici e assorbono nell UV si possono utilizzare lastrine in cui nella fase stazionaria è contenuta una molecola che assorbe la luce UV ed emette fluorescenza. I composti verranno visualizzati come macchie scure su fondo fluorescente. spruzzare la lastrina con una soluzione contenente sostanze in grado di reagire con i costituenti della miscela separata, generando composti colorati

3 Addizione di reagenti cromogeni Alcuni esempi di reagenti correntemente impiegati per evidenziare le macchie sono riportati nella tabella sottostante Reagente Iodio in EtOH AgNO 3 in NH 3 Alizarina Ninidrina HS 2 Utilizzo per composti azotati per sostanze riducenti per cationi per amminoacidi e ammine per cationi e metalli pesanti

4 Cromatografia planare bidimensionale Per aumentare la separazione tra gli analiti e quindi la loro identificazione è possibile effettuare l eluizione lungo due dimensioni: prima lungo un asse e poi, girando di 90 la lastrina, con una fase mobile differente. In questo modo le macchie sono separate in maniera più efficiente

5 Cromatografia ad esclusione molecolare Cromatografia a scambio ionico Cromatografia di affinità Cromatografia di ripartizione Cromatografia di adsorbimento

6 Consente la separazione di molecole in base alle loro dimensioni Il termine gel filtrazione è, infatti, impiegato per descrivere la separazione di molecole di dimensioni diverse utilizzando gel,composti organici polimerici che possiedono una rete tridimensionale di pori che conferisce loro le proprietà di un gel caratterizzata da un limite di esclusione molecolare

7 Nome commerciale Polimero Intervallo di frazionamento (kda) Sephadex G-10 Destrano (polimero glucosio α 1,6) G-25 Destrano 1-5 G-50 Destrano 1-30 G-100 Destrano G-200 Destrano Bio-Gel P-2 Poliacrilammide P-6 Poliacrilammide 1-6 P-10 Poliacrilammide P-30 Poliacrilammide P-100 Poliacrilammide P-300 Poliacrilammide Sepharose 6B Agarosio B Agarosio B Agarosio

8 A contatto con l acqua le particelle delle matrici si rigonfiano originando un gel la cui porosità dipende dal tipo dai legami crociati del polimero Nessuna interazione tra le particelle di gel e le proteine Il gel funge da setaccio molecolare Nella cromatografia per gel filtrazione sia la fase mobile che la stazionaria sono costituite dalla stessa soluzione che è presente all interno dei pori della fase stazionaria e all esterno della fase mobile Ogni particella che costituisce la resina contiene pori di determinate dimensioni; le molecole più grandi passano all esterno dei pori e quindi migrano più velocemente: le molecole più piccole attraversano i pori e quindi migrano più lentamente

9 Per un determinato tipo di gel il coefficiente di ripartizione Kd è funzione della grandezza dell analita. Kd= 0 per un analita che non entra nelle sferette Kd=1 per un analita sufficientemente piccolo che accede completamente nelle sferette Quindi per tutti gli altri analiti di dimensioni intermedie 0<Kd<1 K D = (V e - V 0 ) /V i

10 Cromatografia ad esclusione molecolare Le molecole quindi si distribuiscono, a seconda della loro capacità di penetrare tra le particelle, tra il volume all esterno delle particelle,volume vuoto (V 0 ), e il volume all interno (V i ) Se il volume totale della colonna è V t, V t = V o V i Una molecola che per dimensioni non entra nelle particelle del gel va nel volume vuoto (V 0) assorbanza UV Proteine più grandi Proteine più piccole V 0 V i V t Il volume di eluizione è una funzione lineare del logaritmo del peso molecolare della proteina

11 100kDa 25kDa 10 kda Ogni fase stazionaria è caratterizzata da un limite superiore di esclusione al di sopra del quale le proteine vanno nel volume escluso e da uno inferiore al disotto del quale le proteine non si separano Supponiamo di voler purificare tre proteine di 10, 25 e 100 kda presenti in una soluzione. La Sephadex G-200 con intervallo sarà la resina giusta da utilizzare

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13 La colonna va sempre equilibrata con circa 5 volumi di fase mobile per consentire che ci sia lo stesso tampone all esterno e all itnerno delle sferette di gel

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15 IMPIEGHI PURIFICAZIONE DI MACROMOLECOLE DESALTING DETERMINAZIONE DEL PM DI PROTEINE STUDI DI LEGAME

16 Le colonne Sephadex G-25 possono essere utilizzate per dissalare soluzioni di composti ad alto peso molecolare Le sostanze ad alto peso molecolare sono escluse dai pori, mentre i composti a basso peso molecolare si muovono lentamente Tale metodo è adoperato per allontanare l ammonio solfato da preparazioni proteiche ed i sali dai campioni eluiti dopo cromatografia a scambio ionico

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18 Determinazione peso molecolare 13Da 17kDa 25kDa Una proteina sconosciuta eluisce a 170 ml: 250kDa 450kDa 40,000 Da (40KDa)

19 La cromatografia a scambio ionico si basa sull attrazione tra particelle i carica opposta Le proteine avendo gruppi ionizzabili a differenti ph possono avere carica positiva o negativa in funzione del proprio punto isoelettrico

20 Scambiatori anionici Scambiatori canionici La scelta del tipo di cromatografia a scambio ionico dipende essenzialmente da due parametri: Dal punto isoelettrico della proteina Dal ph del tampone da utilizzare come fase mobile Con questo tipo di cromatografia si riescono a separare proteine con differenza nel pi di circa 0.5

21 Resine a Scambio ionico Si basa sull utilizzo di una particolari resine costituite da scambiatori di ioni che sono dei polielettroliti insolubili Resine cationiche, con gruppi funzionali acidi, si dissociano lasciando un residuo con carica negativa e liberando un catione come contro ione R-SO 3 - H Na Cl - R-SO 3 - Na H Cl - Resine anioniche, con gruppi funzionali basici, si dissociano lasciando un residuo con carica positiva e liberando come contro ione un anione R-N (CH 3 ) 3 OH - H Cl - R-N (CH 3 ) 3 Cl - H OH -

22 Cromatografia a scambio ionico (IEC), alcuni tipi di matrici e scambiatori Ionizzati in uno stretto intevallo di ph Sulfonato Ionizzati a tutti i normali valori di ph a cui si opera Ionizzati in uno stretto intevallo di ph etile Ionizzati a tutti i normali valori di ph a cui si opera

23 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO SCAMBIO ANIONICO SCAMBIO CATIONICO FASE STAZIONARIA Carica POSITIVAMENTE FASE STAZIONARIA Carica NEGATIVAMENTE SCAMBIATORI SCAMBIATORI FORTI DEBOLI FORTI DEBOLI SAX WAX SCX WCX WAX SAX SAX WCX SCX SCX

24 Nella cromatografia a scambio ionico si possono distinguere cinque fasi: 1) Diffusione della molecola alla superficie dello scambiatore. 2) Diffusione della molecola attraverso la struttura della matrice sino al sito dove può scambiarsi con i controioni. Questa fase dipende dal numero di legami crociati presenti e dalla concentrazione della soluzione. Questo stadio controlla la velocità del processo 3) Scambio di ioni al sito di scambio. Questo passaggio si realizza instantaneamente ed è un processo che va all'equilibrio. Quanto maggiore è la carica della molecola da scambiare, tanto più forte è il legame, e meno facilmente può essere sostituita da altri ioni. Scambiatore cationico RSO Na NH 3 R RSO 3... NH 3 R Na Scambiatore Contro-ione ione carico ione legato ione da scambiare scambiato

25 4) Eliminazione dei controioni scambiati 5) Distacco selettivo dello ione lgato ad opera dell'eluente ed eluizione della molecola nel volume esterno. Il distacco selettivo si ottiene modificando ph o forza ionica.

26 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Metodi di eluizione Gradiente di forza ionica Gradiente di ph Competizione per lo scambiatore tra ioni e molecole analizzate Variazione della carica delle molecole comporta il distacco dallo scambiatore FS FS - F - (weak) < OH - < Acetate - < Cl - < SCN - < Br - CrO 4 - < NO 3 - < I - < Oxalate 2- < SO 2 2- < Citrate 3- (strong) Li (weak) < H < Na < NH 4 < K < Rb < Cs < Ag < Mg 2 < Zn 2 < Co 2 < Cu 2 < Cd 2 < Ni 2 < Ca 2 < Pb 2 < Ba 2 (strong)

27 Il ph del tampone deve essere sempre superiore o inferiore di almeno un unità rispetto al punto isoelettrico dei composti da separare. Inizialmente deve essere utilizzato un tampone a bassa forza ionica per permettere la successiva eluizione dei campioni mediante un aumento della forza ionica Eluizione con sali

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30 ESEMPIO Cromatografia a scambio anionico SAX Tre proteine: A: pi = 5, B: pi = 6, C: pi = 7 Punto isolelettrico di una proteina: ph al quale la carica netta di una proteina è Tre uguale proteine: a 0. SAX ph = 8 A--- 3 ad eluire B-- 2 ad eluire Interazione forte Interazione media C- 1 ad eluire Interazione debole SAX - Carica netta della proteina pi ph = 6,5 A-- B- C ph 1 ad eluire ma non si lega alla FS poiché al di sotto del pi presenta carica netta positiva! Eluita con il volume morto, non sottoposta al processo cromatografico - ESCLUSA

31 Cromatografia di affinità La cromatografia di affinità sfrutta l affinità tra un ligando e la proteina di interesse. I ligandi sono generalmente immobilizzati attraverso legami covalenti su una matrice insolubile. La proteina di interesse si lega al ligando laddove le altre proteine fuoriescono dalla colonna. Dopo il lavaggio, la proteina legata può essere eluita aggiungendo gruppi competitori, come il ligando libero o reagenti che distruggono le interazioni. Esempi di interazioni ligando-proteina comprendono quelle ad esempio tra anticorpi e antigeni. assorbimento UV Concentrazione di ligando libero o incremento di forza ionica

32 Cromatografia di affinità M L K 1 ML K -1 Macro molecola Ligando immobilizzato Complesso Una macromolecola si lega in maniera reversibile al ligando specifico immobilizzato sulla matrice mentre le altre componenti presenti nella miscela verranno eluite dalla colonna. L eluizione della macromolecola può essere specifica o aspecifica

33 Purificazione mediante cromatografia di affinità k 1 M L ML macromolecola ligando k -1 complesso (legato alla matrice)

34 Esempi di ligandi gruppo-specifici utilizzati nella cromatografia d affinità LIGANDO AVIDINA EPARINA PROTEINA A E G CONCANAVALINA A LECTINA DI GERMME DI SOIA POLI(A) AFFINITA ENZIMI CHE CONTENGONO LA BIOTINA PROTEINE CHE LEGANO IL DNA IMMUNOGLOBULINE GLICOPROTEINE CON RESIDUI DI -a-d- GALATTOPIRANOSILE GLICOPROTEINE CON RESIDUI DI N-ACETIL-a-D- MANNOPIRANOSILE mrna (poliu)

35 Tetramero di avidina con le quattro molecole di biotina

36 Sistema avidina biotina Diagram of use of CaptAvidin agarose in affinity chromatography. A biotnylated IgG molecule and target antigen are used as an example.

37 Braccio spaziatore Sepharose 4B

38 bracci spaziatori = 1,6-diamminoesano acido 6-amminoesanoico

39 Eluizione specifica Mediante aggiunta di substrato o ligandi per i quali la macromolecola ha una affinità maggiore rispetto a quella del ligando immobilizzato

40 Eluizione aspecifica Attraverso variazione di ph o forza ionica Cuatrecasas et al (1968) PNAS 61:636

41 Eluizione aspecifica

42 Cromatografia d affinità con ioni metallici immobilizzati (I M A C) L IMAC introduce un approccio nuovo nella separazione delle proteine e dei peptidi: la loro affinità per ioni metallici pesanti. Il principio della separazione si basa sul legame differenziale di alcune molecole per gli ioni metallici (Zn, Cu, Cd, Mg, Co, Ni) immobilizzati su matrici tradizionali. Alcuni amminoacidi (His, Cys) formano complessi con i metalli. Le proteine o i peptidi che contengono questi amminoacidi si legano al supporto ad un ph intorno alla neutralità. L eluizione si effettua: Abbassando il ph Con l aggiunta di EDTA nel tampone Con l aggiunta di un competitore (imidazolo per l His) Porath et al. - Nature, 1975, 258, 598

43 Immobilized- Metal Affinity Chromatography (IMAC)

44 Purification of His-tagged proteins

45 Cromatografia di ripartizione cr. liquida in fase normale fase stazionaria polare ad es. alchilammina legata alla silice fase mobile e relativamente non polare di solito un solvente organico in gradiente Ordine di eluizione: Polarità crescente Fase stazionaria può essere polare o apolare Gli analiti polari riciedono per essere eluiti una fase mobile a polarità crescente

46 Cromatografia di ripartizione cr. liquida in fase inversa (RPC) fase stazionaria e non polare gruppi alchilici (butile (C 4 ), ottile (C 8 ), ottadecile (C 18 ), legati alla silice fase mobile relativamente polare può essere un tampone acquoso, metanolo, Acetonitrile, tetraidrofurano, o miscele di questi Ordine di eluizione: Polarità decrescente

47 Reverse Phase Cromatography Diminuzione della polarità

48 Cromatografia di adsorbimento Alcuni materiali possono fungere da adsorbenti di analiti come ad esempio la silice (gruppi Si-OH). Per l eluizione viene scelto un eluente con polarità più vicina all analita più polare presente nella miscela (es.alcol come eluente di analiti che contengono gruppi ossidrilici) Idrossiapatite (Ca 5 (PO 4 ) 3 OH Utilizzata per separare DNA a singolo filamento dal doppio filamento. A basse concentrazioni di tampone fosfato si legano entrambe le specie; aumentando la concentrazione di tampone viene desorbito selettivamente il DNA a singolo filamento, aumentando ancora la concentrazione del tampone viene rilasciato il DNA a doppio filamento)

49 Cromatografia di adsorbimento Interazione idrofobica: sfrutta l idrofobicità superficiale delle proteine per l interazione con gruppi alchilici (esile,ottile) o fenolici legati alla matrice Tale cromatografia viene utilizzata dopo il salting out con solfato d ammonio per facilitare l esposizione delle regioni superficiali idrofobiche delle proteine e consentire l adsorbimento alla fase stazionaria. L eluizione dalla fase stazionaria avviene utilizzando forza ionica gradualmente minore, o utilizzando un competitore che ha un affinità maggiore della proteina per la fase stazionaria

50 Purificazione di proteine mediante separazione con sfere (beads) magnetiche