Tecniche spettrofotometriche e cromatografiche

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1 Tecniche spettrofotometriche e cromatografiche Biochimica e biotecnologie degli alimenti Lezione 3

2 Tecniche spettroscopiche Le radiazioni elettromagnetiche vengono rappresentate sia come un'onda elettromagnetica (natura ondulatoria) che come una serie di pacchetti discreti di energia, i fotoni (natura corpuscolare). La radiazione elettromagnetica è descritta come un fenomeno ondulatorio dovuto alla contemporanea propagazione di perturbazioni periodiche di un campo elettrico e di un campo magnetico, oscillanti in piani tra di loro ortogonali.

3 Ogni radiazione, o onda elettromagnetica, è caratterizzata dai parametri: (ni) (lambda) La frequenzaèunagrandezzacostanteper ogni radiazione Frequenzae lunghezzad'ondasono INVERSAMENTE PROPORZIONALI

4 Tecniche spettroscopiche Energia di una radiazione elettromagnetica Secondola teoriacorpuscolare, unaradiazioneelettromagneticaconsiste in 'pacchettidiscreti' di energia, chiamati FOTONI, la cui energia dipende dalla frequenza, secondo l'equazione: E = hν doveh indicala costantedi Planck: h = 6,63 x J. s ENERGIA E FREQUENZA SONO DIRETTAMENTE PROPORZIONALI Tale relazione indica l'energia associata a ciascun fotone per ogni fascio di frequenza ν; per cui un fascio di luce è più o meno intenso a seconda che porti più o meno fotoni nell'unità di tempo, ma l'energia di ciascun fotone (il quanto di energia), è sempre la stessa per una determinata frequenza della radiazione.

5 Tecniche spettroscopiche I diversi tipi di radiazione elettromagnetica Esistono quindi vari tipi di radiazione elettromagnetica, che differiscono per la loro lunghezza d'onda (e di conseguenza per la loro frequenza ed energia). Spettro delle radiazioni elettromagnetiche:

6 Tecniche spettroscopiche La radiazione visibile rappresenta solo una piccola parte dello spettro elettromagnetico: Alle diverse radiazioni visibili, che differiscono per la loro lunghezza d'onda (e di conseguenza per la loro frequenza ed energia) corrispondono i diversi colori.

7 Tecniche spettroscopiche L'analisi spettrofotometrica consiste nella misurazione di radiazioni elettromagnetiche emesse o assorbite delle sostanze in esame. Poiché ogni sostanza assorbe o emette radiazioni di lunghezza d'onda caratteristica, l analisi spettrofotometrica è in grado di fornire informazioni sia qualitative che quantitative: L'analisi dello spettro permette di individuare la natura della sostanza in esame La misura dell'intensità delle radiazioni emesse o assorbite permette di risalire alla quantità di sostanza analizzata.

8 Principio teorico Atomi o molecole, trovandosi in campi energetici (calorifici, elettrici, elettro-magnetici,...) possono assorbire quantità definite e caratteristiche di energia e passare a stati energetici più alti. S + Energia S* stato fondamentale stato eccitato assorbimento emissione Su questo principio si basano sia la spettroscopia di assorbimento sia quella di emissione. Spettroscopia di ASSORBIMENTO (spettrofotometria e colorimetria) Quando atomi o molecole vengono eccitati da opportune radiazioni elettromagnetiche ( hν ), passando a stati energetici maggiori, si ha il fenomeno di ASSORBIMENTO S + hν S* Spettroscopia di EMISSIONE (fluorimetria e fosforimetria) Dagli stati eccitati, ritornando allo stato fondamentale, gli atomi e le molecole emettono energia sotto forma di radiazioni elettromagnetiche ( hν ) : fenomeno di EMISSIONE S* S + hν Le applicazioni analitiche La lunghezza d'onda delle radiazioni emesse o assorbite sono caratteristiche delle varie sostanze: ciò consente di effettuare analisi QUALITATIVE L'intensità delle radiazioni emesse o assorbite dipendono dalla quantità di sostanza: ciò consente di effettuare analisi QUANTITATIVE

9 Proprietà di assorbimento degli amminoacidi Gli amminoacidi proteici non sono colorati, cioè non assorbono la luce nello spettro del visibile ( nm), ma assorbono tutti la luce violetta (UV) a lunghezza d onda sotto i 220 nm. La capacitàdi assorbire luce UV in un campo spettrale compreso tra i 320 e i 240 nmèèuna caratteristica degli amminoacidi aromatici: FENILALANINA TIROSINA TRIPTOFANO

10 Proprietà di assorbimento degli α-amminoacidi

11 Tecniche spettroscopiche Per effettuare analisi qualitative si fa uso di raggi policromatici a spettro continuo. Le singole radiazioni monocromatiche di tale raggio si fanno passare, una alla volta, attraverso la sostanza in esame, la quale assorbirà in modo diverso, cioè con diversa intensità, le diverse radiazioni. Riportando perciò in un grafico i valori registrati di assorbimento in funzione della lunghezza d'onda, si ottiene lo spettro di assorbimento della sostanza esaminata. Per il fatto che ogni sostanza ha il suo spettro di assorbimento, l'esame di tali spettri permette di identificare una sostanza (per confronto diretto con campioni noti o tramite banche dati di spettri) o di controllarne il grado di purezza.

12 Tecniche spettroscopiche Per eseguire analisi quantitative si fa uso di raggi monocromatici. Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una radiazione attraversa una soluzione, viene assorbita più o meno intensamente in funzione della concentrazione. Appositi dispositivi sono in grado di misurare l'intensità del flusso luminoso ed in particolare: I 0 : intensitàdel flusso luminoso all'ingresso della cella con il campione; I : intensità del flusso luminoso all'uscita della cella con il campione.

13 Legge di Lambert-Beer Dalla misura di I O e I gli strumenti forniscono direttamente i valori di TRASMITTANZA e ASSORBANZA, che rappresentano le grandezze caratteristiche della spettroscopia di assorbimento. Il rapporto tra l'intensità del raggio uscente e quella del raggio entrante si chiama TRASMITTANZA: T = I/I 0 Questa grandezza esprime quale frazione della luce incidente ha attraversato il campione senza essere assorbita. T può assumere valori compresi tra 0 e 1. L' ASSORBANZA è definita come il logaritmo negativo della trasmittanza: A = -log T L'assorbanza viene utilizzata nelle analisi quantitative poiché risulta direttamente proporzionale alla concentrazione. Trasmittanza e assorbanza sono adimensionali (numeri, senza unità di misura).

14 Legge di Lambert-Beer Prendendo in considerazione una cella, contenente una sostanza in soluzione, attraversata da un raggio di luce monocromatica, si dimostra che A = e x l xc dove: A = assorbanza (adimensionale) e = coefficiente di assorbimento molare, caratteristico della sostanza (mol -1 L cm -1 ) l = cammino ottico (cm), cioè lo spessore della soluzione c= concentrazione molare della sostanza (mol/l) L'equazione A = e x l x c rappresenta una retta passante per l'origine degli assi in cui e x l è il coefficiente angolare.

15 Spettrofotometro Dal punto di vista concettuale uno spettrofotometro segue il seguente schema: La luce della lampada passa attraverso un monocromatore per la selezione della lunghezza d onda. Il raggio attraversa la cella in cui è contenuto il campione e viene registrato da un detector collegato con un registratore.

16 Spettrofotometro SORGENTE: lampada di tungsteno (visibile) o lampada a scarica di deuterio (UV) CAMPIONE: si alloggia in celle al quarzo (UV) o in vetro o policarbonato (visibile) CONCENTRAZIONE: bisogna sceglierla in modo tale che l assorbanza non superi il valore di 1-2

17 Spettrofotometro Esistono diversi tipi di spettrofotometro, a seconda di come sono organizzate le varie componenti, tra cui: spettrofotometri monoraggio spettrofotometri a doppio raggio Gli spettrofotometri monoraggio Gli spettrofotometri a doppio raggio

18 Cure di calibrazione C : C ST = A : A ST C = (A /A ST ) C ST

19 Cure di calibrazione

20 Cromatografia Il processo della cromatografia (dal greco chòma, colore e gràphein, scrivere) si basa su interazioni tra una miscela di sostanze da frazionare sciolte in un liquido (fase mobile) ed una matrice solida porosa (fase stazionaria). K= [A staz ] [A mob ]

21 Cromatogramma Per registrare il cromatogramma all uscita della colonna cromatografica si può misurare l Abs a 280 nm(aaaromatici) o a 214/220 nm(legami peptidici) in funzione del tempo o del volume di eluizione.

22 Cromatografia La cromatografia fu introdotta da Tswett nel 1903 che separò i pigmenti solubilizzati da piante usando sostanze adsorbenti solide. Carotenoidi Xantofille Clorofilla a Clorofilla b Si può usare una colonna di vetro riempita con particelle di argilla o una fase stazionaria costituita da materiale granulare (gel di silice, allumina attiva, etc.) adeso su una lastrina di vetro (cromatografia su strato sottile). L eluente utilizzato era etere di petrolio.

23 Cromatografia a scambio ionico Nella cromatografia a scambio ionico le molecole cariche si legano a gruppi immobilizzate sulla matrice (cellulosa o agarosio). Analitacarico negativamente (anione) Analitacarico positivamente (catione) Resine a scambio cationico Struttura Resina a scambio anionico Resina a scambio cationico Resine a scambio anionico Struttura

24 Cromatografia a scambio ionico Le proteine ed altri polielettroliti che hanno gruppi carichi possono legarsi a scambiatori di cationi o di anioni. L affinità per una proteina per lo scambiatore dipende dalla presenza di altri ioni che competono con la proteina per il legame allo scambiatore e dal ph della soluzione che influenza la carica netta della proteina.

25 Cromatografia a scambio ionico Per l eluizione si può sfruttare la competizione per i siti di legame con altri gruppi ionici aumentando la concentrazione di sale dell eluente. In alternativa è possibile variare il ph per modificare lo stato ionico delle molecole legate.

26 Cromatografia a scambio ionico

27 Cromatografia per gel filtrazione La cromatografia per gel filtrazione (esclusione molecolare o setaccio molecolare) le molecole sono separate in base alle loro dimensioni e alla loro forma. La fase stazionaria è formata da granuli di gel contenenti pori di dimensioni variabili. Legami crociati nel polimero di poliacrilammide che costituisce la matrice del gel

28 Cromatografia per gel filtrazione Le molecole grandi percorrono la colonna più rapidamente di quelle piccole che attraversano i pori entrando nei granuli.

29 Cromatografia per gel filtrazione Per molecole separate da in un ambito di dimensioni dei pori esiste una relazione lineare tra il volume di eluizione di una sostanza e il logaritmo della sua massa molecolare (assumendo che le molecole abbiano formule simili). Blu destrano Assorbimento a 280 nm V0 Volume di eluizione Sali Vi Volume della colonna E dunque possibile utilizzando proteine a peso molecolare noto, stimare la sua massa molecolare conoscendo il suo volume di eluizione.

30 Cromatografia per affinità Nella cromatografia per affinità una molecola (ligando) che si lega specificamente alla proteina di interesse è legata covalentemente alla matrice inerte della fase stazionaria. Matrice L Proteina La proteina bersaglio viene recuperata variando la forza ionica del tampone in modo tale da eluire la proteina dalla matrice. A differenza degli altri tipi di cromatografia non si basa sulle differenze nelle proprietà fisiche delle molecole da separare, ma sfrutta le interazioni altamente specifiche delle molecole biologiche.

31 Cromatografia per affinità Esempio di cromatografia per affinità di una proteina che lega il glucosio. L eluizione può essere effettuata mediante l aggiunta di glucosio che compete con il ligando immobilizzato sulla fase stazionaria per il legame alla proteina.

32 Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) L HPLC impiega sistemi automatizzati con campioni applicati in modo preciso, velocità di flusso controllate, mantenute ad alte pressioni, una matrice di plastica del diametro compreso tra 3 e 300 µm e rivestiti di uno strato uniforme di materiale cromatografico. Ciò migliora enormemente la risoluzione e la riproducibilitàdella separazione diminuendo il tempo di esecuzione.

33 Cromatografia HPLC a fase inversa (RP-HPLC) L RP-HPLC sfrutta le interazioni idrofobiche tra le molecole proteiche e la matrice cromatografica contenente gruppi idrofobici (es. C4, C8, C18). I gruppi apolari delle proteine interagiscono con la matrice idrofobica. L eluizione viene effettuata aumentando la percentuale del solvente apolare in maniera tale che le proteine piùidrofilichevengono eluite prima. Analitadi interesse Fase mobile polare Polare Apolare Fase stazionaria apolare Sistemi di solventi comunemente utilizzati: Fase acquosa: Acqua + 0.1% TFA/acido formico Fase organica: Acetonitrile

34 Dialisi La dialisi consente di effettuare il cambio del tampone tra un passaggio cromatografico e l altro. Una soluzione concentrata è separata dal solvente mediante una membrana semipermeabile (solo le piccole molecole possono diffondere attraverso i pori della membrana). All equilibrio, le concentrazioni delle molecole piccole sono equivalenti su entrambi i lati della memrana, le macromolecole rimangono all interno.

35 Monitoraggio della purificazione Unità internazionale (UI) di un enzima: quantità di enzima in grado di convertire una µm di substrato in prodotto in un minuto Attività specifica= Unitàenzimatiche mg di proteine totali Grado di purificazione= attivitàspecifica della frazione attività specifica iniziale U o mg di proteina di interesse nella frazione Resa= U o mg di proteina di interesse nell omogenato X 100

36 Monitoraggio della purificazione

37 Monitoraggio della purificazione In un buon processo di separazione l attività specifica aumenta