Applicazioni della Spettroscopia UV-vis all analisi delle proteine

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1 Applicazioni della Spettroscopia UV-vis all analisi delle proteine La radiazione elettromagnetica Con il termine radiazione s intende normalmente ogni forma di energia che si propaga mediante onde o particelle in moto (luce, suono, raggi cosmici, radioattività, ecc.). Le radiazioni utilizzate in spettroscopia per perturbare la materia, e quindi ottenere informazioni sull'analita di interesse, sono prevalentemente onde elettromagnetiche. La radiazione elettromagnetica è una forma di energia trasmessa attraverso lo spazio ad enorme velocità. Molte delle proprietà delle radiazioni elettromagnetiche sono convenientemente descritte trattando le radiazioni come onde sinusoidali caratterizzate da lunghezza d'onda, λ, frequenza, ν, velocità, c, e ampiezza, A. Diversamente da altri fenomeni ondulatori (per es. le onde sonore), la radiazione elettromagnetica non richiede alcun mezzo di supporto per propagarsi nello spazio, pertanto si propaga velocemente anche nel vuoto. Il modello ondulatorio fallisce nel rendere conto di fenomeni associati con l'assorbimento e l'emissione di energia radiante. Per questi processi, la radiazione elettromagnetica deve essere trattata come una corrente di particelle discrete o pacchetti d'onda chiamati fotoni o quanti. L'energia di un fotone è proporzionale alla frequenza della radiazione. Questi due aspetti della radiazione, la natura ondulatoria e quella corpuscolare sono complementari.

2 L'ampiezza A dell'onda sinusoidale è definita come la lunghezza del vettore elettrico al massimo dell'onda. Il tempo richiesto per il passaggio di massimi (o minimi) successivi attraverso un punto fisso nello spazio è chiamato periodo p della radiazione. La frequenza ν è il numero di oscillazioni del campo per secondo ed è uguale ad 1/p. È importante tenere presente che la frequenza è determinata dalla sorgente e rimane costante indipendentemente dal mezzo attraversato dalla radiazione. Di contro, la velocità di propagazione, v i del fronte d'onda attraverso un mezzo è dipendente sia dal mezzo che dalla frequenza; il pedice i è impiegato per indicare questa dipendenza dalla frequenza. La lunghezza d'onda λ i è la distanza lineare fra massimi o minimi successivi di un'onda. Il prodotto della frequenza in onde per secondo per la lunghezza d'onda in centimetri dà la velocità v i di propagazione in centimetri per secondo v i = ν.λ i La velocità con la quale le radiazioni elettromagnetiche si propagano nel vuoto, c, è indipendente dalla lunghezza d'onda ed è massima: c = 2, cm/s. La velocità nell'aria differisce solo leggermente da c (è circa lo 0,03% in meno). Nel vuoto o nell'aria la velocità della luce è convenientemente arrotondata a cm/s = 3, m/s. 4 Tecniche spettroscopiche Interazione tra luce e materia Tecniche spettroscopiche Informazione qualitativa (elementi, composti) Informazione quantitativa (concentrazione) Lo spettro elettromagnetico I vari intervalli dello spettro elettromagnetico sono sfruttati a scopo analitico per ottenere informazioni strutturali quali-quantitative sulla materia analizzata Energia λ

3 Classificazione delle tecniche spettroscopiche In base al meccanismo assorbimento emissione fluorescenza In base alla regione spettrale impiegata raggi γ (0.01 Å) raggi X (0.01 Å 100 Å) UV-Visibile (10 nm 800 nm) IR (800 nm 0.4 mm) microonde (0.4 mm 0.25 m) radiofrequenze (> 0.25 m) In base alla specie interessata atomica molecolare Assorbimento ed emissione di luce A livello microscopico la luce interagisce con la materia in modalità differenti ma sempre legate a salti tra stati energetici S 1 S 0 ~~~ ΔE = hν L assorbimento e l emissione di luce da parte della materia sono interpretabili come passaggio tra due stati di energia di un atomo o una molecola Regioni spettrali utilizzate Irraggiando la materia con la radiazione luminosa si creano effetti diversi a seconda dell energia della radiazione utilizzata: raggi γ e raggi X provocano transizioni elettroniche nei gusci interni e reazioni nel nucleo raggi UV e visibile causano transizioni elettroniche nei gusci esterni raggi infrarossi causano transizioni vibrazionali e rotazionali microonde e onde radio interessano l orientazione degli spin elettronici e nucleari

4 Spettroscopia molecolare: assorbimento il campione è irraggiato con luce avente λ nell UV, nel visibile o nell infrarosso (bande o righe) le molecole che compongono il campione assorbono l energia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile) l entità di questa interazione fornisce la risposta analitica qualitativa (quali composti) identificazione attraverso le λ assorbite quantitativa (qual è la concentrazione) calibrazione con soluzioni a concentrazione nota legge di Lambert-Beer (A = εbc) Spettroscopia UV-Visibile Aspetti generali. Queste regioni dello spettro elettromagnetico e le tecniche ad esse associate sono le più usate per lavori di routine e ricerca in problematiche biologiche. Lo spettrofotometro è uno dei mezzi migliori per fare analisi quantitativa. Lo strumento matematico per questi studi è la legge di Lambert-Beer. Assorbanza o D.O. Coeff. Di estinzione Cammino ottico A = ε c l ε = A cl Concentrazione, quasi sempre Molarità ε = A per cammino ottico e concentrazione unitari A non ha dimensioni A = log 10 (1/T) = log 10 (I 0 /I) I 0 intensità raggio incidente I intensità raggio uscente Strumentazione Il materiale usato nelle parti ottiche dipende dalla lunghezza d onda usata. UV: prismi,., cuvette in quarzo o polimetil metacrilato sopra i 350 nm vetro borosilicato o provettine di plastica (polistirene) spettrofotometria

5 Il detector è una fotocellula dove una superficie sensibile riceve fotoni ed una corrente viene generata che è proporzionale all intensità del raggio di luce che raggiunge la superficie. Per strumenti UV/VIS ci sono due lampade: 1 al tungsteno -----> VIS 1 all idrogeno o deuterio > UV La lunghezza d onda di 350 nm è il punto di switch fra l una e l altra. Monocromatore -----> seleziona la lunghezza d onda con prismi (rifrazione) o mediante reticoli (diffrazione). Cromoforo: parte di una molecola che dà assorbimento (aminoacidi aromatici ) La sostanza è in soluzione. E sciolta cioè in un mezzo che di solito è l acqua o un tampone. Sia il mezzo che il contenitore non devono assorbire e devono essere scelti a seconda della lunghezza d onda. Selezione della lunghezza d'onda Gli spettrofotometri sono equipaggiati con uno o più dispositivi per selezionare una stretta banda, assorbita o emessa dall'analita (banda passante). Una banda passante stretta aumenta la probabilità che lo strumento risponda linearmente alla concentrazione di analita. I due tipi principali di selettori di lunghezza d'onda sono i monocromatori ed i filtri. I monocromatori hanno il vantaggio che la lunghezza d'onda in uscita può essere variata continuamente in un intervallo spettrale considerevole. I filtri offrono il vantaggio di semplicità, robustezza e basso costo. I monocromatori dei moderni spettrofotometri sono prismi e, principalmente, reticoli. 14 Celle I contenitori per il campione che sono usualmente chiamati celle, cellette o cuvette, devono avere finestre costruite con un materiale trasparente nella regione spettrale di interesse. Le migliori cellette hanno finestre che sono normali alla direzione del raggio per minimizzare le perdite dovute alla riflessione. La lunghezza di celletta più comune per gli studi nelle regioni ultravioletta e visibile è 1 cm. Celle di polistirene per misurazioni spettrofotometriche di routine nel visibile ( nm). 15

6 Spettrofotometria UV-visibile Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di λ; le λ assorbite, aventi energia sufficiente a promuovere transizioni elettroniche, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento Gli spettrofotometri UVvisibile sono molto diffusi per la loro semplicità di utilizzo e versatilità e per il basso costo; quasi tutte le sostanze organiche presentano assorbimenti nel range strumentale ( nm) Un utilizzo molto comune si ha come rivelatore per HPLC Transizioni elettroniche La spettroscopia UV-visibile è detta anche spettroscopia elettronica perchè è basata su transizioni di elettroni tra livelli energetici diversi Le transizioni elettroniche più comuni sono illustrare nella figura sottostante. Esse si verificano se nel campione sono presenti molecole aventi cromofori, cioè gruppi funzionali in grado di assorbire la luce. Solo le transizioni di elettroni n e π hanno energie nel range nm Applicazioni dell UV-visibile caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi monitoraggio di cinetiche di reazione caratterizzazione della purezza di un composto o di un prodotto naturale (es. olio, vino) determinazione quantitativa di specie di interesse chimico-clinico o ambientale (A = εbc) rivelazione in sistemi cromatografici

7 Spettro di assorbimento della clorofilla: Sono visibili due transizioni principali a 670 nm (rosso) e 430 nm (blu). Cromofori nelle proteine Il legame peptidico (210 nm) Centrato a 280 nm Ponte disolfuro (250 nm) Applicazioni alle proteine Zone di assorbimento diverse nm nm nm nm UV (legame peptidico) UV medio (amino acidi aromatici) vicino UV (gruppo eme) VIS (gruppo eme)

8 Aminoacidi aromatici Determinazione della concentrazione di proteine in soluzione Cromofori di una proteina: legame peptidico Tyr max a 276 nm Trp max a 280 nm Phe max a nm (poco) ci si riferisce all aminoacido libero Metodo diretto Assorbimento a 280 nm Problematiche: differente contributo di ciascun aa all Assorbanza totale interazione fra anelli aromatici diversi Metodo indiretto Ad es. Bradford. Blu di Comassie di colore marroncino legandosi alla proteina diventà blu. A 595 nm si misura l Assorbanza del complesso Misura della concentrazione di proteine in soluzione (mg/ml) Il metodo di Bradford

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10 Esempio di applicazione