Distribuzione AA in banca dati

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1 Aminoacidi

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4 Distribuzione AA in banca dati

5 Distribuzione AA in banca dati

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11 (rappresenta l'assorbanza provocata da una soluzione a concentrazione molare unitaria della sostanza ad una data lunghezza d'onda, attraverso una cella di lunghezza ottica unitaria)

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24 Sono solo 20 gli aminoacidi in natura codificati geneticamente?? 1. Il 21esimo aminoacido la selenocisteina 2. Il 22esimo aminoacido la pirrolisina 3. Forse altri..

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27 Protein AminoAcids Name (Residue) 3 letter code Single code Relative abundance (%) E.C. MW pk VdW volume(å3) Charged, Polar, Hydrophobic Alanine ALA A H Arginine ARG R C+ Asparagine ASN N P Aspartate ASP D C Cysteine CYS C P Glutamate GLU E C Glutamine GLN Q P Glycine GLY G Histidine HIS H P,C+ Isoleucine ILE I H Leucine LEU L H Lysine LYS K C+ Methionine MET M H Phenylala. PHE F H Proline PRO P H Serine SER S P Threonine THR T P Tryptophan TRP W P Tyrosine TYR Y P Valine VAL V H

28 Hydroxylation of proline and lysine Phosphorylation of Serine & Tyrosine Naturally occuring chemical modifications of genetically encoded amino acids R group methylation of lysine, histidine and arginine. R group acetylation of lysine. N terminal methylation of alanine. N terminal acetylation of serine. N terminal formylation of methionine. Addition of carbohydrates (at Asparagine and Serine). Addition of Lipids (at Cysteine, N terminal glycine and C terminal via carbohydrate linker group) Covalent attachment of cofactors (eg. pyridoxal 5 phosphate attached at lysine; hemes attached at cysteines).

29 Reazioni degli aminoacidi La reattivita dei gruppi α aminici e α carbossilici non varia nei diversi aminoacidi: I gruppi carbossilici possono formare amidi ed esteri I gruppi aminici possono formare basi di Schiff e amidi Le catene laterali esibiscono specifiche reattivita chimiche: I residui di Cys possono formare disulfidi e venire facilmente alchilati Alcune reazioni sono specifiche per certe di catene laterali

30 A reazione con l ammoniaca dà amidi non sostituite B reazione con amina primaria dà amidi sostituite C reazione con alcoli in ambiente fortemente acido D può avvenire polimerizzazione per ripetizione ciclica di questa reazione. Il gruppo carbossilico deve essere opportunamente esterificato Gli aminogruppi liberi possono reagire con aldeidi per fare basi di Schiff Possono essere acilati con anidridi acide

31 Alcune reazioni delle catene laterali

32 Ninidrina= trichetoidrindene idrato e un agente ossidante che causa deaminazione ossidativa della funzione alfa aminica. I prodotti sono l aldeide risultante ammoniacoa CO2 e idrindantina un derivato ridotto della ninidrina. L ammoniaca puo reagire poi con l idrindantina e un altra molecola di ninidrina per dare un prodotto porpora che puo essere quantificato spettrofotometricamente a 570nm. Puo essere misurata anche l evoluzione di CO2, che indica la presenza di un alfa aminoacido. Gli alfa imminoacidi, come la prolina e la idrossiprolina danno prodotti gialli per reazione con la ninidrina (assorbimento max a 440nm) permettendo di distinguere questi dagli alfa aminoacidi. E usata in medicina forense per rilevare impronte digitali. Oggi si usano reagenti fluorescenti piu sensibili

33 Separazione di miscele di Aminoacidi Mikhail Tswett, un botanico russo, separò per primo pigmenti colorati da estratti di piante facendo una cromatografia Esistono molti metodi cromatografici per la separazione di misture di aminoacidi chromatografia a scambio ionico (tradizionale) High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

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35 Separazione di aminoacidi su di una colonna scambiatrice di cationi

36 Separazione di aminoacidi secondo Moore e coll., Gli aminoacidi sono applicati ad una colonna scambiatrice di cationi a ph 4.25, gli aminoacidi acidi (pk ) si legano debolmente e gli aminoacidi basici si legano fortemente. Per eluire si usa sodio citrato a due diverse concentrazioni e a 3 valori di ph

37 Cromatogramma HPLC di aminoacidi con derivatizzazione precolonna con o phthaldialdehyde (OPA) (Jones e coll., 1981) Risoluzione molto alta, alta sensibilita, molto veloce HPLC colonne di acciaio impaccate con particelle + piccole e piu uniformi. Le alte pressioni riducono i tempi. Riducono le diffusioni laterali e permettono migliori risoluzioni. La derivatizzazione precolonna con composti fluorescenti o Uv permette l analisi a livelli picomolari (derivanti da 1 2 migrogr di prot) Colonna: reverse phase ODS Fase mobile:a: tetraidrofurano/metanolo/acetato di sodio(0.5 M ph5.9) 1/19/80 B: metanolo/acetato di sodio (0.5M ph 5.9) 4/1 Flusso: 1.7ml/min

38 La conoscenza della sequenza amminoacidica di una proteina costituisce il prerequisito per la determinazione della sua struttura tridimensionale ed è essenziale per comprenderne il suo meccanismo d azione molecolare I confronti tra le sequenze di proteine analoghe ottenute da specie differenti consentono di approfondire le nostre conoscenze sulla funzione di queste proteine e svelano le relazioni evolutive tra le proteine e gli organismi che le sintetizzano Numerose malattie ereditarie sono causate da mutazioni che determinano una sostituzione amminoacidica in una proteina le analisi delle sequenze amminoacidiche possono essere di ausilio nello sviluppo di test diagnostici e di terapie efficaci La proteina da sequenziare deve essere scissa in frammenti sufficientemente brevi da poter essere sequenziati individualmente, poi, partendo dalla sequenza dei tratti sovrapposti, si ricostruisce la struttura primaria della proteina intatta

39 DEGRADAZIONE DI EDMAN 1. Il reagente di Edman, fenilisotiocianato (PITC), reagisce con il gruppo amminico N-terminale di un polipeptide in condizioni blandamente alcaline, per formare il feniltiocarbamile (PTC) 2. Tale addotto è trattato con acido trifluoroacetico (F 3 CCOOH) anidro, che libera il residuo N-terminale sotto forma di derivato tiazolinonico, senza idrolizzare gli altri legami peptidici 3. Il derivato tiazolinone-amminoacido è estratto selettivamente con un solvente organico ed è convertito nel più stabile derivato feniltioidantoina (PTH) mediante trattamento con un acido in soluzione acquosa Condizioni basiche Analisi tramite HPLC Derivato tiazolinonico TFA 100% anidro Condizioni blande acide in acqua Derivato feniltioidantoina (PTH) (più stabile)

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41 Identificazione del PTH-aa N-terminale mediante cromatografia Il tipo di amminoacido è identificato con una cromatografia per mezzo di amminoacidi standard di riferimento Separazione dei 20 PTH-aa

42 Dopo circa 30 cicli diventa difficile determinare la sequenza amminoacidica. Ciò accade perché, dopo un numero elevato di cicli, gli effetti cumulativi di reazioni incomplete e di reazioni secondarie del processo di degradazione di Edman rendono impossibile una identificazione certa dell amminoacido rilasciato e quindi della sequenza amminoacidica. Per tale motivo la proteina da sequenziare è scissa in piccoli frammenti polipeptidici. Una volta determinata la sequenza di ognuno di essi, si procede con la determinazione della sequenza della proteina completa mediante il principio della sovrapposizione dei peptidi.

43 Proteina di 150 aa N ter K------K------R R K C ter N ter K cter N ter K cter N ter R cter N ter R cter N ter K cter Idrolisi con TRIPSINA, peptidasi dotata di elevata specificità: taglia i legami peptidici dal lato C (verso il terminale carbossilico) dei residui carichi positivamente Arg (R) e Lys (K), se il residuo successivo non è Pro 1 peptide 2 peptide 3 peptide 4 peptide 5 peptide N ter C ter 6 peptide

44 Separazione dei PEPTIDI mediante cromatografia Determinazione della sequenza N-terminale di ciascun peptide N ter K cter 1 peptide N ter K cter 2 peptide N ter R cter 3 peptide N ter R cter 4 peptide N ter K cter 5 peptide N ter C ter 6 peptide

45 E necessario adoperare un metodo diverso per generare una serie di frammenti peptidici differenti Anche in questo caso si procederà alla determinazione della sequenza N-terminale di ciascun peptide ottenuto Le due serie di sequenze peptidiche sovrapposte consentono di ricostruire la sequenza di ciascun polipeptide

46 I risultanti gruppi sulfidrilici liberi sono alchilati, di norma mediante trattamento con iodoacetato, per prevenire la riformazione dei ponti disolfurici attraverso ossidazione da parte di O 2

47 Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly i. Determinazione della composizione in ammionoacidi cromatografia a scambio ionico eluzione in funzione del ph

48 Scambiatore cationico forte ph 1 2 (tutti gli aa si legano) Eluizione tramite aumento di ph e forza ionica: 1. aa acidi (es. aspartato e glutammato) 2. aa neutri (es. glicina e valina) 3. aa basici (es. lisina e arginina) Rivelazione tramite ninidrina

49 ii. Identificazione del residuo amino terminale (a) marcatura con cloruro di dansile idrolisi Il composto fluorescente dansil cloruro reagisce con le ammine primarie formando polipeptidi dansilati. Il trattamento di un polipeptide dansilato con un acido in soluzione acquosa ad alta temperatura idrolizza i suoi legami peptidici ed il residuo N-terminale risulta così libero. Questo derivato può poi essere separato dagli altri amminoacidi per via cromatografica ed identificato grazie alla sua intensa fluorescenza gialla. (b) degradazione di Edman: rimozione di un amminoacido alla volta dall estremità NH 2 -terminale

50 a-c Ala c-e Gly

51 Degradazione di Edman Lunghezza massima 50 residui perdita di attendibilità Tagli specifici con metodi chimici o enzimatici Reagente Taglio chimico Bromuro di cianogeno O-iodobenzoato Idrossilammina 2-Nitro-5-tiocianobenzoato Taglio enzimatico Tripsina Clostripaina Proteasi dello Stafilococco Sito di taglio Lato carbossilico di residui Met Lato carbossilico di residui Trp Legami Asp-Gly Lato aminico di residui di Cys Lato carbossilico di residui Lys e Arg Lato carbossilico di residui Arg Lato carbossilico di residui Asn e Gln

52 Prima proteina sequenziata Sanger F., Tuppy H. (1951) The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin 2. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates. Biochem. J. 49: Si dimostró che la sequenza era costituita solo da L-aminoacidi uniti tra loro da legami peptidici fra i gruppi α-amminici e i gruppi α-carbossilici

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