Laboratorio di Biologia Molecolare

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Serafino Paoletti
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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DELL AQUILA DIPARTIMENTO DI MEDICINA CLINICA, SANITÀ PUBBLICA, SCIENZE DELLA VITA E DELL AMBIENTE in collaborazione con Laboratorio di Biologia Molecolare Estrazione del DNA da tessuto

2 Premessa Il DNA in tutte le cellule eucariotiche è localizzato nel nucleo e qui è condensato con proteine varie che concorrono alla formazione della cromatina. Quindi per poter estrarre il DNA da una cellula eucariotica, bisogna dapprima rompere la cellula, poi è necessario staccare il DNA dalle proteine ad esso legate ed infine procedere al recupero dell acido nucleico. Quindi la procedura operativa sarà divisa in 3 parti: estrazione/filtrazione, rimozione delle proteine, recupero del DNA. PREREQUISITI conoscere la struttura del DNA e della Cromatina; conoscere la struttura della cellula eucariotica (animale e vegetale); conoscere i concetti di idrofobicità, idrofilicità ed anfifilicità delle molecole; conoscere il concetto ed il meccanismo d azione dei tensioattivi; conoscere il concetto di osmosi; conoscere il concetto di attività enzimatica; conoscere il concetto di solubilità. OBIETTIVI OPERATIVI: Utilizzo delle tecniche di frazionamento cellulare; Utilizzo di tecniche di precipitazione frazionata delle proteine; Utilizzo di metodiche di recupero e manipolazione degli acidi nucleici; Apprendimento delle tecniche di utilizzo delle pipette da laboratorio. METODO HOME-MADE (ECONOMICO) MATERIALE OCCORRENTE: Da preparare il giorno prima Alcool denaturato ghiacciato (-20 C) Ghiaccio Soluzione per disinfezione delle lenti a contatto (contenente proteasi) oppure succo di ananas non pastorizzato (contiene Bromelina una potente proteasi) Soluzione di estrazione del DNA Termometro Carta assorbente Contenitori vari Acqua Distillata Sale da cucina Siringa da 5 o10 ml Bacchetta di vetro, pipette pasteur o spiedini di legno

3 Colino da thè e compresse di garza ùsoluzione di Estrazione del DNA - Versare 3 g di sale (circa 1 cucchiaino da cucina) e 80 ml di acqua distillata in un becker da 100 ml (o altro recipiente graduato) - Mescolare fino allo scioglimento del sale - Con la siringa prelevare 10 ml di detersivo per il lavaggio a mano delle stoviglie e aggiungerlo alla soluzione - Portare a 100 ml con l acqua distillata PROCEDURA PER L ESTRAZIONE DEL DNA DA FRUTTA: Estrazione: prevede la rottura meccanica del tessuto vegetale e la successiva lisi per via osmotica (in mezzo ipotonico) e per mezzo della solubilizzazione delle membrane grazie al tensioattivo. I detergenti ed i grassi hanno in comune la struttura molecolare, costituita da una testa idrofilica ed una coda idrofobica. Le molecole di saponi e di grassi tendono a formare delle micelle, con le teste rivolte verso l'ambiente acquoso e le code riunite a formare una struttura idrofoba. Mettere 30g di polpa di banana (o altro frutto) su un tagliere e schiacciarla con una forchetta fino a trasformarla in poltiglia (si può anche usare un frullatore ad immersione ma evitando di stressare troppo i tessuti vegetali, non si devono surriscaldare) Versare la poltiglia in un becker Versare la soluzione di estrazione nella poltiglia (30 gr poltiglia ml soluzione estrazione) Porre il becker a bagnomaria nel bagnetto C (oppure in una pentola con acqua calda sul fornello controllando ogni tanto la temperatura col termometro per impedire che il DNA si denaturi) Mescolare la poltiglia per 15 minuti Mettere il becker a bagnomaria nell acqua con cubetti di ghiaccio (per raffreddare subito la soluzione di estrazione) Mescolare la poltiglia per 5 minuti in ghiaccio per uniformare la temperatura Togliere il becker dall acqua fredda Filtrazione: permette di eliminare tutti i frammenti grossolani derivanti della procedura di estrazione. Versare in un colino da Thè rivestito da 2-3 compresse di garza incrociate, la poltiglia derivante dall estrazione sopra riportata. Attenzione si deve recuperare il filtrato in un recipiente posto sotto il colino. Recuperare l estratto nel recipiente posto sotto il colino (in alternativa è preferibile centrifugare). Rimozione delle Proteine:

4 consente di idrolizzare le proteine provenienti dell estratto tissutale, in particolare di quelle che sono legate al DNA formando con esso la cromatina. A questo punto le cellule e le membrane nucleari sono state rotte, così come quelle degli altri organelli cellulari (mitocondri, cloroplasti). Ciò che rimane è quindi costituito da: proteine, carboidrati (zuccheri) e DNA. Il DNA nel nucleo è ricoperto da proteine, ripiegato ed impacchettato. Il ruolo degli enzimi (proteasi) è quello di liberare il DNA degradando le proteine. Versare in una provetta 5 ml di soluzione filtrata Aggiungere a 5ml di estratto, o 1 ml di succo d ananas (contiene Bromelina) oppure 1 ml di liquido per le lenti a contatto Incubare per 30 minuti a 55 C Al termine dell incubazione mettere in ghiaccio e lasciare indefinitamente fino all operazione successiva (evidenziamento e recupero del DNA) Evidenziamento e recupero del DNA: grazie a questa procedura si separa il DNA dal resto della soluzione sfruttando la proprietà del DNA di non essere solubile a freddo in acqua. Infatti essendo l'alcool meno denso dell'acqua tende a galleggiare sopra lo strato acquoso. Si formano così due strati separati con caratteristiche diverse. I grassi, le proteine ed il DNA devono quindi decidere dove distribuirsi. La scelta è dettata da motivi di preferenza per l'ambiente. In questo caso le proteine ed i grassi rimangono nella fase acquosa, mentre il DNA si sposta nella fase contenente l'alcool Aggiungere alcool freddo (-20 C) con la siringa facendolo scendere lungo le pareti della provetta, evitando che si mescoli con il filtrato (il volume dell alcool deve essere pari a quello della soluzione, cioè circa 6 ml) Lasciare riposare la provetta per 5 minuti per far precipitare il DNA All interfaccia tra l alcool e il sottostante filtrato si potrà osservare una sostanza bianca la cui quantità tende ad aumentare. Procedere al recupero del DNA o con bacchetta di vetro, o con una pipetta pasteur piegata o con uno spiedino di legno DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI DNA IN SOLUZIONE ATTRAVERSO METODI SPETTROFOTOMETRICI (OPZIONALE) PROTOCOLLO: Si determinerà la concentrazione di una soluzione di DNA. Si userà sia la spettrofotometria nell utravioletto (UV) che la valutazione dopo elettroforesi in gel d'agarosio. Impostare lo spettrofotometro sulla doppia lunghezza d'onda di 260/280 nm. In una cuvetta di quarzo (o plastica per UV) porre 1ml di acqua (bianco) e azzerare lo strumento (a 260/280 nm). Preparare una cuvetta di quarzo contenente 999ml di H20 e aggiungere 1ml della soluzione di DNA (diluizione 1:1000). Coprire con parafilm e miscelare capovolgendo delicatamente la cuvetta.

5 Introdurre la cuvetta nello spettrofotometro e leggere l'assorbanza (A) a 260 e 280 nm. Coi risultati ottenuti, calcolare la concentrazione di DNA sapendo che in una cuvetta con un cammino di 1 cm, il DNA a doppio filamento alla concentrazione di 50mg/ml ha un assorbimento di 1 a 260nm: Concentrazione DNA /mg/ml)=a260nm x 50mg/ml 1 Unità assorbimento Per risalire alla concentrazione iniziale della soluzione moltiplicare il valore ottenuto per il fattore di diluizione (x1000) Se l Assorbanza è troppo alta o troppo bassa riprovare con altre diluizioni! Calcolare il rapporto delle letture a 260nm e 280nm. Tale rapporto dovrebbe essere >= 1.7 per una preparazione pura di DNA. Se il rapporto è < di 1.7 significa che è presente una contaminazione da parte delle proteine. NOTE, RISULTATI E CONCLUSIONI: L'entità dell'assorbimento varia in funzione della natura del DNA, infatti DNA denaturato assorbe di più. In particolare l'assorbanza (A) è in proporzione alla concentrazione, come descritto dalla legge di Lambert-Beer (che è valida solo per luce monocromatica). A260nm A280nm Con coefficiente di purezza = A260/A280 = Dove se questo valore è maggiore o uguale a 1.7 si a una preparazione pura di DNA, altrimenti è presente una contaminazione proteica. METODO KIT (COSTOSO) In parallelo l'estrazione del DNA sarà effettuata anche utilizzando un kit commerciale per confrontare la qualità del prodotto finale.

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