Spettrofotometria. Foto di Clotilde B. Angelucci

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1 Spettrofotometria Foto di Clotilde B. Angelucci

2 Le radiazioni elettromagnetiche e lo spettro Una radiazione elettromagnetica è caratterizzata dalla sua frequenza (ν) o dalla sua lunghezza d onda (λ). Queste sono tra loro correlate dalla velocità della luce (c) secondo la seguente relazione: ν= c/λ

3 Spettroscopia nell ultravioletto e nel visibile Sono le regioni dello spettro elettromagnetico maggiormente utilizzate nelle ricerche in campo biomedico

4 . Una sostanza può essere identificata proprio in base al pattern di lunghezze d onda assorbite. Nelle piante i pigmenti responsabili del colore verde sono la clorofilla a e b. Le piante sono verdi perché questi composti, altamente coniugati, non assorbono la luce verde, ma semplicemente la riflettono. Nelle foglie ci sono anche licopene, il b-carotene e le antocianidine. In autunno, quando la clorofilla si degrada è possibile apprezzare anche questi colori. Foto di Clotilde B. Angelucci

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6 Lo spettro di assorbimento La misura dell assorbanza di una soluzione permette di generare un grafico, lo spettro d assorbimento del campione, in cui sull asse delle Y si pongono i valori dell assorbanza e sull asse delle X le lunghezze d onda. Il massimo di assorbimento per una qualunque sostanza pura in soluzione corrisponde alla lunghezza d onda dove l assorbimento è massimo.

7 Spettrofotometro Bianco costituito dal solvente fatta eccezione del campione a cui si vuole analizzare l assorbimento Sistema sdoppiamento raggi bianco Sistema riallineamento raggi Prisma campione Sorgente luminosa Monocromatore Comparto celle Rivelatore Luce: Visibile/ultravioletto Radiazione proveniente dal monocromatore si divide in due raggi che sono inviati al bianco e al campione contemporaneamente Il secondo raggio passa attraverso il campione e fuoriesce con l intensità trasmessa (I campione ) Il computer registra entrambe in modo alterno e calcola il rapporto

8 Cosa si misura con uno spettrofotometro? Lo spettrofotometro può essere usato, oltre che per determinare gli spettri di assorbimento di una sostanza, anche per misurare le concentrazioni di sostanze in soluzione. L energia luminosa trasmessa si può misurare come trasmittanza: il rapporto tra l energia della luce trasmessa (I) e della luce incidente (I 0 ). d Luce incidente I 0 I Luce trasmessa

9 d Luce incidente I 0 I Luce trasmessa Trasmittanza T = I/I 0 Assorbanza A = -Log T = LogI o -Log I La trasmittanza non è proporzionale alla concentrazione di soluto e per questo viene convertita in assorbanza, proporzionale alla concentrazione di soluto

10 I 0 Assorbimento del campione a concentrazione C I Intensità di luce INCIDENTE Intensità di luce TRASMESSA Maggiore è la quantità di molecole che la luce incontra, maggiore è l assorbimento, minore è l intensità di luce trasmessa.

11 Relazione tra concentrazione ed assorbimento di una sostanza ad una certa lunghezza d onda sorgente mocromatore campione rilevatore I 0 I Legge di lambert-beer: A = LogI o /I =ecd c = concentrazione Molare (moli/l) della sostanza che assorbe la luce. d = lunghezza del cammino ottico espressa in cm. e = Coefficiente di Estinzione Molare caratteristico della sostanza che assorbe luce mol -1 L cm -1

12 Coefficiente di Estinzione Molare A = ecd Se d = 1 cm e = A/cd Se c = 1 M e = A Coefficiente di Estinzione Molare rappresenta l assorbanza di una soluzione con concentrazione 1 M e cammino ottico unitario (1 cm)

13 Coefficiente di Estinzione Molare Effetto solvente. II solvente può provocare una significativa variazione nei livelli energetici di una molecola. Scelta del solvente: Un ipotetico solvente «ideale», per la registrazione di spettri UV/visibile, non deve assorbire a nessuna lunghezza d onda di questa gamma spettrale; tuttavia, nessun solvente «reale» soddisfa questo requisito. L acqua di grado analitico è il solvente di uso più comune.

14 Cuvette e piastre: Plastica per luce visibile

15 Vetro per luce visibile

16 Quarzo per luce ultravioletto

17 Spettrofotometria in Biochimica e Biologia Molecolare

18 Cromofori delle proteine Legame peptidico assorbe a 210 nm Aminoacidi aromatici assorbono a 280 nm Le cisteine assorbono a 250 nm Ogni proteina ha un e differente

19 Spettro di assorbimento di una proteina Lehninger Principles of Biochemistry

20 Le basi azotate hanno un massimo di assorbimento a 260 nm. Lehninger Principles of Biochemistry

21 Spettro di assorbimento di un acido nucleico Lehninger Principles of Biochemistry

22 Per il DNA, utilizzando cuvette di 1 cm di cammino ottico ad un valore di assorbanza a 260 nm pari a 1 unità di assorbimento, corrisponde una concentrazione di DNA di 50 µg/ml. Invece, per l RNA corrisponde una concentrazione di RNA di 40 µg/ml Osservando lo spettro, è possibile valutare anche la purezza del DNA isolato. Per un DNA di buona qualità il rapporto dei valori di assorbimento a 260 e 280 nm deve essere di 1,8. Se tale rapporto risulta inferiore significa che ci sono possibili contaminazioni di proteine o composti fenolici.