Spettroscopia Raman. Trasmissione-assorbimento

Transcript

1 Spettroscopia Raman Quando una radiazione monocromatica di frequenza n o e incidente ad un sistema molecolare la luce viene: assorbita se ha energia pari ad una possibile transizione ad un livello energetico superiore (es. Uv-vis, IR); riflessa se non interagisce con la materia; diffusa se interagisce senza causare transizioni energetiche Riflessione Trasmissione-assorbimento Diffusione La diffusione della luce e uno dei più evidenti effetti ottici, e si verifica perché gli oggetti responsabili della diffusione (le molecole) hanno dimensioni molto piccole rispetto alla lunghezza d onda della radiazione visibile ( nm).

2 Spettroscopia Raman La spettroscopia Raman e una spettroscopia di tipo vibrazionale ed è basata sul processo di diffusione Raman.

3 Spettroscopia Raman La tecnica sfrutta un fenomeno fisico scoperto nel 1928 dal fisico Indiano C.V. Raman, che gli valse il premio Nobel nel Egli scoprì che una piccola frazione della radiazione diffusa da certe molecole aveva energia diversa da quella della radiazione incidente, e che la differenza di energia era legata alla struttura chimica delle molecole responsabili della diffusione: l effetto Raman,

4 Spettroscopia Raman Quando un raggio laser, di lunghezza d onda λo monocromatica, colpisce una molecola ovvero un insieme di molecole, la maggior parte della intensità luminosa verrà diffusa in tutto lo spazio senza cambiamento di lunghezza d onda. Solo una piccolissima porzione dell energia luminosa verrà diffusa con lunghezze d onda diverse da quella laser. hn un piccola parte della radiazione diffonde elasticamente in tutte le direzioni senza perdita di energia, cioè alla stessa frequenza della radiazione incidente (diffusione elastica o Rayleigh). hn la maggior parte della radiazione passa attraverso il campione hn una parte ancora più piccola viene diffusa anelasticamente cedendo (diffusione Raman Stokes) o acquisendo (diffusione Raman anti- Stokes) energia nell'interazione con la molecola,

5 Effetto Raman Il fenomeno Raman e interpretato ammettendo che il sistema sia eccitato ad un livello molto instabile (livello virtuale, che non corrisponde a nessun livello stazionario della molecola): La luce incidente induce il movimento degli elettroni di legame. Tali elettroni in movimento riemettono luce. Il livello e talmente instabile che nel tempo di sec, prima cioe che avvenga un qualsiasi urto, la stessa radiazione e spontaneamente riemessa ed il sistema ritorna allo stato fondamentale.

6 Diffusione della luce Considerando l interazione luce-materia in termini di particelle, possiamo immaginarla come una collisione tra i fotoni e le particelle che formano il campione irraggiato. I fotoni che interagiscono con le particelle del campione e vengono retrodiffusi possono essere di due tipi: se la diffusione avviene per interazione elastica, cioè senza trasferimento netto di energia, i fotoni (ovvero la radiazione diffusa) hanno la stessa energia di quelli incidenti: questo fenomeno è noto come diffusione Rayleigh e costituisce l evento più frequente se la diffusione è conseguenza di una interazione anelastica, cioè con trasferimento di energia dal fotone ad una particella o viceversa, il fotone diffuso ha energia rispettivamente minore o maggiore di quello incidente: questo è la diffusione Raman o effetto Raman, che avviene su un numero assai limitato di eventi, circa 1 su 10 6

7 Effetto Raman

8 Effetto Raman se la molecola assorbe parte dell energia del fotone per passare ad uno stato eccitato, il fotone riemergerà con un energia (frequenza) minore di quella d incidenza andando a formare le cosiddette righe Stokes dello spettro Raman

9 Effetto Raman se invece la molecola si trova già in uno stato vibrazionale eccitato, a causa dell'eccitazione termica, può cedere energia al fotone incidente che riemergerà dall urto con un energia maggiore andando a formare le righe anti-stokes.

10 Spettro Raman Spettro Raman di CCl 4 eseguito utilizzando per l eccitazione una riga laser con l=488 nm

11 Spettro Raman La maggior parte delle collisioni tra la radiazione eccitatrice e le molecole è di tipo elastico, solo circa 1 su 10 6 collisioni è anelastica La riga con la stessa frequenza della sorgente, derivante dalla diffusione Raleigh della radiazione incidente, è la componente di gran lunga più intensa dello spettro Raman e deve essere allontanata.

12 Spettro Raman Poiché a temperatura ambiente il livello vibrazionale V0 è più popolato di V1, il passaggio dallo stato vibrazionale fondamentale al primo eccitato è più probabile del passaggio inverso e quindi le linee Stokes sono più intense di quelle anti-stokes

13 Sorgente di Eccitazione Nella diffusione Raman, la luce incidente può avere una qualsiasi frequenza. La differenza Dn e indipendente dalla frequenza della luce incidente n.

14 Sorgente di Eccitazione Nella diffusione Raman, la luce incidente può avere una qualsiasi frequenza. La differenza Dn e indipendente dalla frequenza della luce incidente n. FASCIO MONOCROMATICO E INTENSO Gli spostamenti in frequenza della radiazione diffusa dalla radiazione incidente sono molto piccoli e di conseguenza la radiazione incidente deve essere monocromatica per poterli osservare. Inoltre l intensità della radiazione diffusa è molto bassa, quindi è necessario che il fascio incidente sia anche molto intenso.

15 Sorgente di Eccitazione Si osservano spettri Raman adoperando sorgenti nel visibile o nell UV. Nella maggior parte dei campioni reali, i deboli segnali Raman sono oscurati dalla fluorescenza di fondo. In generale, la fluorescenza diminuisce se la lunghezza d'onda passa dal visibile alla regione del vicino IR (NIR), cioè se diminuisce l'energia della sorgente di eccitazione. Questo fa sì che, come sorgenti di eccitazione, si scelgano comunemente il laser o i diodi laser (che emettono nel rosso lontano e nel NIR, riducendo la fluorescenza di fondo)

16 Intensità SpettroRaman Nello spettro Raman si ha in ordinata l intensità di emissione luminosa e in ascissa la frequenza assoluta in cm -1 oppure, più comunemente, lo spostamento Raman o Raman shift, cioè la differenza in numeri d onda tra la radiazione osservata e la radiazione incidente. Numeri d'onda (cm-1) E+07 1.E+06 1.E+05 1.E+04 1.E+03 1.E+02 1.E+01 1.E Raman shift (cm-1)

17 Spettroscopia IR e Raman Lo spettro Raman è quindi uno spettro vibrazionale, come lo spettro IR, ma da questo differisce per due motivi fondamentali: 1. lo spettro Raman viene generato dalla differenza di due livelli elettronici (la cui differenza è pari ad un livello vibrazionale); la sorgente dello spettrometro è perciò nel visibile, anche se ora sono molto diffuse sorgenti nel NIR. 2. gli spettri Raman ed IR differiscono per le regole di selezione delle transizioni.

18 Spettroscopia IR e Raman Le due tecniche sono perciò complementari: nello spettro FT-IR del Dicloro-acetofenone è evidente lo stiramento del legame C=O a circa 1700 cm -1, che è quasi assente nello spettro FT-Raman.

19 Regola di selezione la polarizzabilità molecolare deve variare con la distanza internucleare.

20 Regola di selezione b + + a + E - Gli elettroni in una molecola formano una nuvola di carica elettronica intorno ai nuclei che costituiscono lo scheletro molecolare (figura a). Sotto l effetto del campo elettrico (E) della radiazione elettromagnetica questa nuvola viene deformata (figura b) in modo tale che si forma un momento di dipolo elettrico μ proporzionale al campo secondo la relazione: m=ae

21 Regola di selezione b + + E - La polarizzabilita e una misura della distorsione della nuvola elettronica, ossia della mobilità degli elettroni, in presenza del campo elettrico : tanto maggiore è la polarizzabilità, tanto piu facilmente la nuvola elettronica si orienta secondo la direzione del campo in modo da generare un momento indotto piu grande.

22 Regola di selezione b + + E - Per effetto della distorsione determinata nella distribuzione dei loro elettroni e nella posizione dei loro nuclei, le molecola apolari possono acquistare un momento dipolare quando sono poste in un campo elettrico (momento di dipolo indotto)

23 Regola di selezione la polarizzabilità molecolare deve variare con la distanza internucleare. Per legami con un forte momento di dipolo (che sono attivi all IR) la mobilità per polarizzabilità è generalmente bassa. Per legami che hanno un debole momento di dipolo, la polarizzabilità è generalmente alta e gli stati vibrazionali di tale legame sono Raman attivi.

24 REGOLA DI SELEZIONE GENERALE PER L OSSERVAZIONE DEGLI SPETTRI RAMAN VIBRAZIONALI: la polarizzabilità molecolare deve variare con la distanza internucleare. La regola di selezione specifica per le transizioni vibrazionali Raman nell ambito dell approssimazione armonica è Dv = ± 1

25 H 2 O Raman + IR: 3657 cm 1 Raman + IR: 3756 cm 1 Raman + IR: 1594 cm 1

26 Variazione di dipolo elettrico Variazione di polarizzabilità Lo stiramento simmetrico è una vibrazione inattiva in infrarosso. Comporta però una variazione della polarizzabilità per cui questa vibrazione e Raman attiva.

27 Lo stiramento anti-simmetrico è una vibrazione infrarosso attiva. E' invece Raman inattiva in quanto non varia la polarizzabilità.

28

29 A vantaggio della tecnica Raman sono il fatto che l acqua e il vetro non causano interferenze, diversamente dall IR, e che le linee dello spettro Raman sono generalmente più strette e quindi più semplici da identificare. A vantaggio della tecnica IR è invece il fatto che gli spettri siano solitamente più ricchi di segnali e quindi la tecnica risulta di più generale applicazione

30 Spettroscopia Raman Risonante Se la luce di eccitazione utilizzata per un esperimento Raman coincide con la banda di assorbimento per una transizione elettronica, si osserva una grande aumento di intensità dello spettro Raman. Questa tecnica si chiamata spettroscopia Raman Risonante (RR). Ne segue che il processo di risonanza Raman è accoppiato al processo della transizione elettronica con intensificazione del segnale Raman che può essere anche di ordini di grandezza rispetto alla spettroscopia Raman. L intensificazione del segnale dipende dal coefficiente molare di assorbimento della banda elettronica e dalla vicinanza della lunghezza d onda di eccitazione con la lunghezza d onda della transizione elettronica.

31 Spettroscopia Raman Risonante

32 Spettroscopia Raman Risonante Questa tecnica trova utilizzo nello studio di biomolecole che presentano un forte assorbimento nel visibile e nell'ultravioletto. Possibilità di misurare selettivamente lo spettro di assorbimento di un cromoforo anche in presenza di un forte background di altre bande vibrazionali

33 Spettroscopia Raman Risonante Molti aminoacidi hanno transizioni elettroniche con massimi di assorbimento nella stessa regione dell'assorbimento del gruppo peptidico. Perciò, se gli aminoacidi fanno parte di una catena polipeptidica, è difficile osservarne gli spettri di RR, poiché le loro transizioni elettroniche hanno un coefficiente di estinzione molare minore di quella del gruppo peptidico e sono inoltre in numero minore rispetto ai legami peptidici. Ne segue che gli aminoacidi che meglio si rivelano in RR sono quelli che assorbono a l>230 nm e cioè gli aminoacidi aromatici.

34 Spettroscopia Raman Risonante Gli spettri di RR della Phe, Tyr e Trp, ottenuti con varie frequenze di eccitazione sono dominati dai modi dell'anello benzenico. Variando semplicemente la lunghezza d'onda della radiazione incidente, che e' in risonanza con i diversi stati elettronici eccitati, nei tre spettri sono intensificati modi differenti (hanno cioe profili di eccitazione differenti). Perciò e' possibile distinguere le bande dei diversi cromofori aromatici, anche in spettri di proteine molto complicate, semplicemente variando la lunghezza d'onda della radiazione incidente.

35 Spettroscopia Raman Risonante

36 Spettroscopia Raman Risonante Il rapporto tra le intensità tra le bande, I850/I830, della tirosina e una sonda sensibile dello stato del legame ad idrogeno e di ionizzazione del gruppo OH della tirosina. Si ha variazione di intensità del doppietto a seconda che la tirosina sia esposta al solvente o sepolta all interno della proteina.

37 Spettroscopia Raman Risonante Il riscaldamento porta alla rottura dei legami a H delle catene polipeptidiche e delle interazioni idrofobiche e idrofiliche, comportando una esposizione della tirosina.

38 Spettri Raman del DNA La spettroscopia Raman e' sicuramente una metodica molto importante per lo studio del DNA. Entrambe le spettroscopie Raman convenzionale e risonante forniscono informazioni strutturali. Per un esperimento di RR la lunghezza d'onda della radiazione eccitatrice deve cadere all'interno della banda di assorbimento della molecola, che per gli acidi nucleici va tra 200 e 280nm. D'altra parte, pero' in questa maniera si perdono tutte le informazioni strutturali provenienti dalle vibrazioni dello scheletro. E per questa ragione che la maggior parte degli studi sul DNA e RNA sono stati eseguiti utilizzando l'effetto Raman classico, adoperando righe eccitatrici nel visibile.

39 Spettri Raman del DNA La spettroscopia Raman e' sicuramente una metodica molto importante per lo studio del DNA. La spettroscopia si è rivelata molto utile per distinguere i vari tipi di DNA grazie a bande marker sensibili sia al tipo di base sia alla conformazione dello zucchero Le vibrazioni delle basi contengono informazioni strutturali concernenti le interazioni di stacking delle basi ed i legami ad idrogeno fra le basi. Le alterazioni indotte nello spettro Raman delle basi sono dovute a cambiamenti conformazionali.

40 Spettri Raman del DNA