SAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed Ambientali. School of Agriculture, forest, Food and Environmental sciences.

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Ricardo Nobile
5 anni fa
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1 Protocollo SAFE Protocollo di estrazione DNA da colture di fermenti lattici (metodo del salting-out; Dr. Lara Aponte) Reagenti: Tampone STE (per lavaggio delle cellule) Tampone di lisi Tampone TE (per conservazione e diluizione del DNA) SDS al 25% (w/v) pronase E (20 mg/ml) ammonio acetato 5 M isopropanolo etanolo al 70% Metodo: 1. Centrifugazione a rpm per 10 min di 2 ml di brodocoltura in MRS in fase esponenziale 1 di crescita; allontanare completamente il surnatante; se il pellet è insufficiente ripetere con altri 2 ml di biomassa 2. Risospensione del pellet cellulare in 1 ml di STE; 3. Centrifugazione a rpm per 10 min; allontanare completamente il surnatante (il lavaggio deve essere effettuato 2 volte); 4. Risospensione in 250 µl di tampone di lisi 5. Incubazione a 37 C per 2 h (è possibile l'incubazione overnight, se necessario); 6. Aggiunta di 25 µl di SDS al 25% (w/v) e leggera agitazione per inversione (in questa fase si osserva la formazione di filamenti viscosi e bianchi); 7. Aggiunta di 2 µl di pronase E (20 mg/ml); 8. Incubazione a 37 C per 1 ora; 9. Raffreddamento a 0 C (in ghiaccio) per 15 min; 10. Aggiunta di 1 volume (280 µl) di ammonio acetato 5 M a 4 C; 11. Incubazione per 15 minuti a 4 C; 12. Centrifugazione a rpm a 4 C per 15 min; 13. Prelievo del sovranatante (circa 400 µl; il surnatante dovrebbe contenere il DNA, se torbido occorre ricentrifugare; è preferibile cercare di prelevare con precisione 400 µl evitando di disturbare il pellet); 1 il protocollo di lisi ha una durata complessiva di almeno 7 ore; se si desidera una coltura in fase esponenziale da lavorare in mattinata bisogna inoculare con lo 0.1% e incubare overnight la brodocoltura; in alternativa si può inoculare in mattinata con 1-2%, incubare per 6 h e fare la lisi overnight 1

2 14. Aggiunta di 0,7 volumi (280 µl) di isopropanolo freddo (-20 C); all'aggiunta di isopropanolo dovrebbe essere chiaramente visibile la precipitazione di DNA, sotto forma di filamenti biancastri o semitrasparenti; dopo centrifugazione il pellet deve essere il più trasparente possibile; 15. Incubazione per 15 minuti a 0 C (in ghiaccio); 16. Centrifugazione a rpm a 4 C per per 15 min; 17. Eliminare il surnatante 18. Lavaggio del pellet con 250 µl di etanolo al 70% (questo passaggio è necessario per eliminare l'ammonio acetato che inibisce le reazioni di amplificazione, il lavaggio può essere ripetuto se necessario); 19. Centrifugazione a a 4 C per 15 min; 20. Eliminare il surnatante 21. Asciugatura del pellet sotto cappa a flusso laminare al fine di allontanare completamente l etanolo (capovolgere le eppy aperte su uno strato di carta e lasciare asciugare fino a quando il pellet diventa traslucido); 22. Risospensione in 50 µl di TE; fare attenzione ad agitare bene, perché parte del DNA potrebbe essere depositato sulle pareti; 23. Incubazione a 55 C per 0,5-1 ora al fine di risospendere completamente il DNA; Controllo al Nanodrop della concentrazione e qualità del DNA in soluzione (in alternativa controllo su gel di agarosio al 1.0% con 10 µl/well). 24. il DNA può essere conservato circa 24 h a 4 C; per periodi più lunghi usare -20 C o meglio -80 C. Preparazione reagenti Tampone ET: Trizma base50 mm, EDTA 5 mm, ph 8,0. Sciogliere 3.02 g di Trizma base in un matraccio tarato da 500 ml e corregge il ph a 8,0 con HCl 6 M. Sciogliere 0.93 g di EDTA in un matraccio tarato da 500 ml e corregge il ph a 8,0 con HCl 6 M. Unire le due soluzioni e ricontrollare il ph. Sterilizzare. NOTA: questo tampone è concentrato 5x rispetto al TE. Trizma base Trizma base 50 mm P305 + P351 + P338 EDTA P305 + P351 + P338 EDTA 5 mm Tampone ET 2

3 Tampone TE (per conservazione e diluizione del DNA): 10 mm Tris ph 8.0 e 1 mm EDTA ph 8.0. Preparare il tampone ET secondo le direttive sovrastanti e diluire 100 ml di questo con acqua deionizzata in un matraccio tarato da 500 ml. Controllare che il ph sia ph 8. Sterilizzare. Tampone STE (per lavaggio delle cellule): NaCl 100 mm, Trizma base 10 mm ph 8, EDTA 1 mm ph 8. Aggiungere in un matraccio tarato da 100 ml, 0.58 g di NaCl e portare a volume con TE. Controllare che il ph sia ph 8. Sterilizzare. SDS al 25% (w/v): pesare 7,5 g di SDS in 30 ml di acqua distillata. L SDS tende a cristallizzare per cui è opportuno riscaldare a bagnomaria la bottiglietta prima dell utilizzo. SDS SDS 25% R11 R21/22 R36/37/38 R36 R37 R38 H228 H302 H311 H318 P280 P305 + P351 + P338 P312 P260 P280 Tampone di lisi: ET contenente lisozima 10 mg/ml; RNase 1 mg/ml; mutanolisina 50 U/ml (la mutanolisina può essere omessa per gli streptococchi, enterococchi e lattococchi, ma è necessaria per i lattobacilli). Sono disponibili soluzioni madre di RNase 10 mg/ml e di mutanolisina 10KU. Per ogni campione occorrono 250 µl di tampone di lisi. Se ad esempio occorre estrarre 24 campioni, saranno necessari 6 ml di tampone ET contenente 0.06 g di lisozima, 0.06 g di RNase e se occorrente, 30µL di mutano lisina 10 KU. Pronase E (20 mg/ml): 3

4 Pronase E Pronase E (20mg/ml) H334 P305 + P351 + P338 P342 + P311 Ammonio acetato 5M: sciogliere 39 g in 100 ml di dh 2 O.. Isoproponaolo: aliquotare 20 ml in un paio di tubi di polipropilene e sistemarli a -20 C. Isopropanolo R11 R36 R67 P305 + P351 + P338 Etanolo 70%: In un pallone da 50 ml diluire 35 ml di etanolo assoluto. Etanolo R11 4

5 Etichette della Miscela: SDS 25% v/v,, P260, P280 Questo reagente può essere irritante per pelle, occhi e apparato respiratorio. Non respirare. Evitare il contatto con la pelle. Miscela: Isopropanolo P305 + P351 + P338 Liquido e vapori facilmente infiammabili. Provoca grave irritazione oculare. Tenere lontano da fonti di calore/scintille/fiamme libere/superfici riscaldate Miscela: Etanolo 70% Tenere lontano da fonti di calore/scintille/fiamme libere/superfici riscaldate 5

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