Estrazione di proteine - Scelta della fonte biologica

Dimensione: px

Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "Estrazione di proteine - Scelta della fonte biologica"

Gerardina Bello
5 anni fa
Visualizzazioni

1 Estrazione di proteine - Scelta della fonte biologica Proteine endogene Batteri Cellule eucariotiche Proteine ricombinanti Lieviti Tessuti

2 Localizzazione della proteina

PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE 1 proteina da 10.000-20.

raggiungere dipende dagli scopi. Cosa si intende per proteina pura?

3 PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE 1 proteina da proteine diverse (in una cellula, tessuto) Il grado finale di purezza che si vuole raggiungere dipende dagli scopi. Cosa si intende per proteina pura?? E praticamente impossibile raggiungere il 100% Ad es. è sufficiente il 90% per determinare la sequenza aminoacidica e anche solo il 50% per studiare la cinetica di un enzima

4 Cellule/Tessuti Compartimenti subcellulari Lisi, omogenizzazione, sonicazione, centrifugazione, tecniche cito-istologiche Classe di macromolecole Macromolecola specifica Densità, solubilità, peso molecolare, carica elettrica, proprietà ottiche, struttura chimica

5 Composizione del tampone di estrazione 1. Impiego di Good Buffers Di norma M forza ionica (per mantenere il ph) e ph da 7.0 a Riducenti: DTT (ditiotreitolo), b-me (b-mercaptoetanolo), glutatione ridotto. L interno della cellula è un ambiente riducente. 3. Inibitori di enzimi: rilascio di enzimi proteolitici (dai lisosomi ad es.) Per rallentare la proteolisi : a) 4 C; b) inibitori di proteasi specifici per le diverse classi: -serin proteasi: PMSF (fenil metil sulfonil fluoruro), leupeptina -tioloproteasi: iodoacetato e cistatina -asparticoproteasi: pepstatina -metalloproteasi: EDTA e 1,10 - fenantrolina -esopeptidasi: amastatina e bestatina 4. Inibitori di fosfatasi: Na 3 VO 4, NaF, 5. EDTA: per rimuovere ioni metallici che possono reagire con gruppi tiolici 6. Substrati enzimatici e cofattori: il substrato e/o i cofattori possono stabilizzare l enzima. 7. Detergenti: Se proteine di membrana

6 Metodi di rottura delle cellule Meccanici Non meccanici Frullatori French press Sonicatori Lisi per osmosi "Freeze and thaw" Omogenizzatori Enzimatici Solubilizzazione chimica

7 1) Lisi per osmosi 2) Freeze and thaw: congelando e scongelando rapidamente e ripetutamente si rompono le membrane a causa della formazione di cristalli di ghiaccio

8 2) Metodi enzimatici:: Batteri gram+: lisozima (taglia i peptidoglicani) + shock osmotico/freeze-thaw; Batteri gram-: EDTA (destabilizza il LPS esterno rimuovendo Ca 2+ ) e detergente per membrane + lisozima + shock osmotico/freeze-thaw. Lieviti: zimolasi e liticasi (attività glucanasica e proteolitica) + shock osmotico/freeze-thaw. Metodi enzimatici >>> solo in laboratorio (costi troppo elevati per l industria).

9 3) Solubilizzazione chimica: la rottura delle membrane è operata da detergenti (non-ionici, anionici, cationici, zwitterionici, es. SDS (anionico), Triton X-100, Tween-20, NP-40 (non-ionici), CHAPS (zwitterionico)).

10 4) omogenizzazione: : il tessuto viene messo in un provettone di vetro all'interno del quale agisce un pistone di vetro o di Teflon (Dounce/Potter) che può essere azionato a mano o mediante un motore elettrico. Le membrane saranno lacerate dalle forze frizionali potter-pareti. Potter Dounce Frullatori

11 : 4) French Press: per batteri e lieviti. Le cellule scoppiano e rilasciano il loro contenuto a causa di una notevole riduzione della pressione applicata.

cavitazionali (compressione e rarefazione dovuta a formazione e scoppio

12 5) Sonicazione: ideale per sospensioni cellulari, ultrasuoni ad alta frequenza (> 20KHz) x > > distruzione cellule per forze taglienti e cavitazionali (compressione e rarefazione dovuta a formazione e scoppio bolle). Per volumi piccoli (inferiori ai 50 ml), in ghiaccio (sviluppa calore).

Documenti analoghi

Strategie per la purificazione delle proteine

Strategie per la purificazione delle proteine Attenzione! C è differenza tra separazione per alcuni scopi analitici (Gel-electrophoresis, IEF, 2D-gels) e purificazione In una cellula ci possono essere