Moltissimi metaboliti e componenti macromolecolari delle cellule viventi sono acidi o basi, e sono potenzialmente ionizzabili

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1 Moltissimi metaboliti e componenti macromolecolari delle cellule viventi sono acidi o basi, e sono potenzialmente ionizzabili La carica di queste molecole è un fattore determinante nella velocità catalitica degli enzimi, nella stabilità conformazionale delle proteine, nell interazione delle macromolecole tra di loro e con ioni Le caratteristiche chimico-fisiche, tra cui la carica, vengono utilizzate nelle tecniche analitiche e nella purificazione delle molecole biologiche

2 IONIZZAZIONE DELL ACQUA H O H + + OH 2 + H OH Keq = = H O 2 16 M a 25 C H2O = 55, 5M Keq H2O = H OH = M K = + W H OH } + H OH = M 2 H + = M

3 [H + ] < 10-7 SOLUZIONE BASICA ph = - log 10 [H + ] K = + W H OH = ph + poh = 14 [H + ] = 10-7 SOLUZIONE NEUTRA [H + ] > 10-7 SOLUZIONE ACIDA { log 10 [10-5 ] = -5 [H + ] = log 10 [H + ] = 5 ph = 5

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5 ACIDI e BASI HA + H O A + H O Acido base Base coniugata Acido coniugato K eq = A H O + 3 HA H O 2 K = K H O = a eq 2 A H O + 3 HA

6 K A H O a = + HA 3 pk = log K a 10 a Relazione tra ph, [HA] e [A - ] H O K HA + 3 = a A + log H O = log K + log log H O = log K + log a a HA A A HA ph = pk + log a A HA Equazione di Henderson - Hasselbalch

7 ph = pk + log a A HA A = HA log A HA = 0 ph = pk a

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9 MECCANISMO DI FUNZIONAMENTO DELLE SOLUZIONI TAMPONE 1 l di acqua 1l di soluzione [CH 3 COOH] = 0,1 M [CH 3 COO - Na + ] = 0,1 M H O = OH = Aggiungiamo 0,001 M HCl H O = ph = 3 ΔpH = 7-3 = 4 CH 3 COOH + H 2 O CH 3 COO - + H 3 O + + H 3 O H O = K a Aggiungiamo 0,001 M HCl H O ph = 4,735 CH COOH CH COO ΔpH = 4,745 4,735 = 0, , 1 = 18, 10 = 18, 10 0, 1 ph = 4,745 = pk = 18, , 1 + 0, 001 = 184, 10 0, 1 0, 001

10 + H 3 O = K a CH COOH 3 CH COO 3 Dall esempio risulta che affinché una soluzione sia tamponante, è necessario che il rapporto acido debole base coniugata possa essere considerato praticamente costante prima e dopo aggiunta di acido o di base. A tal fine è necessario, in pratica, che la quantità massima di acido o base aggiunta sia dell ordine di 1/50 1/100 delle quantità delle specie tamponanti. Come si può dimostrare matematicamente, a parità di aggiunte di acido o di base, acido debole il massimo della capacità tamponante si ha per = 1 base coniugata ovvero quando ph pk a

11 UN SISTEMA TAMPONE UTILIZZABILE PER LA RICERCA DEVE: Possedere un adeguata capacità tamponante nell intervallo di ph richiesto Essere disponibile commercialmente in forma pura Essere molto solubile in acqua Possedere un valore di pk a poco influenzabile dalla temperatura e dalla concentrazione salina del mezzo Non essere tossico Non assorbire la luce nel visibile e nell ultravioletto vicino.

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15 TAMPONI COMMERCIALI

16 Misurazione del ph

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18 Misurazione del ph

19 Il materiale di partenza per un esperimento Modelli in vivo: Si applicano a organismi multicellulari, ci si avvale di animali, o parti di essi i cui organi vengono irrorati con nutrienti, oppure a piante o parti di esse sospese in soluzione fisiologica Modelli in vitro: Richiedono l incubazione di materiale derivato biologicamente in ambienti fisicamente e chimicamente artificiali Il termine in vitro si può applicare a preparazioni enzimatiche, a granuli isolati, a colture cellulari

20 Nelle incubazioni con organi e tessuti si cerca di mantenere l attività metabolica il più possibile (ma è sempre un periodo limitato) Nelle tecniche di coltivazione cellulare si forniscono condizioni di crescita adatte alla divisione e allo sviluppo in vitro delle cellule per un tempo prolungato, da pochi giorni a parecchi mesi. condizioni chimico-fisiche controllate: ph, osmolarità, temperatura (incubatore a CO 2 ) richieste del mezzo di coltura: ioni inorganici, fonte di carbonio/ energia, agenti antimicrobici (antibiotici), antifungini, antimicoplasma (es: mezzi di coltura prodotti commercialmente con aggiunta o meno di siero).

21 Scelta del tipo di coltura da usare: Colture primarie e tessuti: riflettono con maggiore probabilità le attività metaboliche e biochimiche della cellula in vivo, hanno vita limitata. Linee cellulari continue: sono più facili da coltivare. I requisiti di crescita sono noti. Le risposte sono riproducibili trattandosi di colture clonali

22 Cappe sterili Trattamento al calore Radiazioni Filtrazione Agenti chimici Tecniche di sterilità Calore rosso (fiamma bunsen) Calore secco (stufa a 160 C, 2h) Calore umido (autoclave 121 C, 15 min) Raggi UV, radiazioni ionizzanti Filtri di 0.2 o di 0.45 mm di diametro Rimuovono i batteri ma non i virus Disinfettanti (etanolo, candeggina etc.) Rimuovono i batteri ma non sempre spore e virus Azione lenta, almeno 10 minuti

23 Omogeneizzazione e frazionamento di cellule e tessuti Isolamento delle molecole biologiche e dei complessi subcellulari del materiale di partenza Dopo la distruzione e/o omogeneizzazione l ambiente in vitro risulterà molto diverso da quello delle cellule intatte È importante che l integrità della molecola in questione sia conservata

24 Distruzione delle cellule e solubilizzazione delle proteine - scelta del tampone di estrazione: di norma ha una forza ionica ed un ph simili a quelli dell ambiente intracellulare (0,1 0,2 M; ph 7-8); Nel tampone possono essere incorporati, per ragioni specifiche, altri composti: I) stabilizzante come saccarosio (impedisce la lisi osmotica e stabilizza le proteine idrofobiche); II) un antiossidante (β-mercaptoetanolo, ditiotreitolo, cisteina, glutatione ridotto); III) inibitori di enzimi (proteasi), come il fenilmetil sulfonil fluoruro (PMSF) o la tosilfenilalanilclorometilchetone (TPCK; inibitori delle serina proteasi), iodoacetato e cistatina (inibitori delle tiolo proteasi), etilendiaminotetracetato (EDTA; inibitore delle metalloproteasi), pepstatina (aspartico proteasi); VI) substrati enzimatici e cofattori; V) Sodio azide (batteriostatico); VI) Detergenti (Triton X-100, Tween-20, SDS), provocano la dissociazione delle proteine di membrana.

25 Cellule di mammifero. Diametro di 10 µm. Membrana plasmatica debolmente sostenuta dal citoscheletro. Cellule vegetali. Diametro di 100 µm. Parete cellulare rigida (cellulosa, lignina, cera) attorno alla membrana plasmatica. Suscettibili a forze taglienti a causa delle grandi dimensioni. Batteri. Diametro di 1-4 µm. Parete cellulare rigida. Gram+ e Gram. Peptidoglicani e lipopolisaccaridi. Possono secernere proteine nello spazio periplasmatico. Funghi e lieviti. Parete cellulare rigida di polisaccaridi (mannano, glucani e chitina) e glicoproteine. Possono secernere proteine nello spazio periplasmatico.

26 Distruzione delle cellule e solubilizzazione delle proteine - metodi di rottura delle cellule: a) Omogeneizzazione (cellule animali o vegetali). Non adatto per batteri o lieviti, se non tramite frantumazione con palline. b) Frantumazione con abrasivi (batteri, lieviti o cellule vegetali), usando un pestello, in presenza di tampone, sabbia e allumina. DYNOMILL (su larga scala, con sferette di vetro e dischi rotanti). c) Presse, come la French press. La sospensione cellulare viene spinta attraverso un piccolo orifizio da una pompa a pistone, ad alte pressioni. d) Metodi enzimatici (batteri e lieviti). Lisi della parete cellulare e shock osmotico. Il lisozima taglia il peptidoglicano della parete batterica. La zimolasi e la liticasi, usate per i lieviti, hanno attività glucanasica. La chitinasi viene usata per i funghi filamentosi. e) Sonicazione (cellule microbiche). Onde sonore ad alta frequenza.

27 (pasta congelata, con abrasivo) Tecniche di distruzione di tessuti e cellule

28 Esempi di strumenti per l omogenizzazione N.B.: raffreddare tampone e strumento prima di procedere all omogenizzazione.

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30 FRAZIONAMENTO CELLULARE E PURIFICAZIONE DELLE MACROMOLECOLE BIOLOGICHE Gran parte del lavoro tecnico negli studi biochimici è costituito dalla purificazione dei materiali che si vogliono analizzare. La nostra conoscenza dei processi biochimici è proceduta in parallelo con la nostra capacità di purificare i materiali biologici. Analizzeremo insieme le tecniche utilizzate per l isolamento, la purificazione e, per alcuni aspetti, la caratterizzazione delle proteine. La comprensione di queste tecniche è di fondamentale importanza per apprezzare il significato e le limitazioni della conoscenza biochimica.

31 PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE Le proteine costituiscono la classe di molecole più rappresentate negli organismi viventi. Una particolare proteina (emoglobina) può essere il principale costituente di un tessuto (sangue), oppure può essere presente solo in poche copie per cellula (repressore dell operone lac di E. coli). In entrambi i casi vengono usate le stesse tecniche di purificazione, anche se tanto più è bassa la concentrazione iniziale della proteina che si vuole purificare tanto più è complicato isolarla in forma pura. Comunque, nella pratica è pressoché impossibile ottenere una purezza del 100% Il grado di purezza richiesto dipende dal tipo di studi che si vogliono condurre. Maggiore è la purezza che si desidera raggiungere, minore sarà la resa.

32 ISOLAMENTO DELLE PROTEINE Scelta della fonte della proteina. Distruzione delle cellule e solubilizzazione delle proteine. Dosaggio delle proteine (misurazione della loro concentrazione). Strategia generale per la purificazione: metodi di frazionamento.

33 Scelta della fonte della proteina: - organismo - tessuto - compartimenti cellulari } Quantità diverse Proprietà diverse - tecnica del DNA ricombinante

34 Strategia generale per la purificazione: metodi di frazionamento. - Il fatto che le proteine fossero sostanze chimiche ben definite non venne accettato per intero finché James Sumner nel 1926 cristallizzò la prima proteina: l ureasi del fagiolo. - Le proteine vengono purificate tramite procedimenti di frazionamento. In una serie di tappe indipendenti, le proprietà chimico-fisiche della proteina che ci interessa purificare vengono sfruttate per separarla progressivamente dalle altre sostanze e dalle altre proteine. - Le caratteristiche chimico-fisico utilizzate sono: a) la solubilità; b) la carica ionica; c) la massa molecolare d) le proprietà di assorbimento; e) l affinità di legame ad altre molecole.

35 Dosaggio delle proteine (misurazione della loro concentrazione). - per poter purificare una proteina (o qualsiasi sostanza) è necessario disporre di un metodo che ci possa rivelare quantitativamente la sua presenza; - questo metodo deve essere specifico, sensibile e semplice da attuare: a) Saggi di attività enzimatica. b) Saggi di attività biologica. c) Tecniche immunochimiche. - si deve anche disporre di un metodo per misurare la concentrazione totale delle proteine, al fine di calcolare il grado di purificazione e la resa.