BIOCHIMICA APPLICATA e CLINICA

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1 BIOCHIMICA APPLICATA e CLINICA Regolazione Enzimatica Biosegnalazione Regolazione Ormonale Specializzazioni metaboliche (Biochimica d Organo) Integrazione del metabolismo

2 BIOCHIMICA APPLICATA e CLINICA Password Moodle: BACfarma Regolazione enzimatica, Biosegnalazione, Regolazione delle vie metaboliche, Integrazione metabolica Nelson DL e Cox MM - I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, (V edizione) Zanichelli 2010 Cap. 6, 12, 14, 15, 16,17, 19, 21, 23 Ormoni Levy MN, Koeppen, BM, Stanton, BA PRINCIPI DI FISIOLOGIA di Berne & Levy, (IV edizione) Elsevier Masson 2007 Capitoli in alternativa Carbone E, Cicirata F e Aicardi G FISIOLOGIA dalle molecole ai sistemi integrati (I edizione) EdiSES 2008 Capitoli 20-25, 28 Biochimica d organo Caldarera CM BIOCHIMICA SISTEMATICA UMANA, (II edizione), CLUEB Economica, 2007 (.pdf allegato)

3 REGOLAZIONE ENZIMATICA Cap. 6, 15 Lehninger L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO Legge di Michaelis-Menten CONTROLLO GENICO Viene regolata la quantità dell enzima CONTROLLO ALLOSTERICO INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE (Partners) MODIFICAZIONI COVALENTI REVERSIBILI Fosforilazione MODIFICAZIONI COVALENTI IRREVERSIBILI taglio proteolitico della catena enzimatica

4 Cinetica secondo Michaelis e Menten Il valore di K M è una misura di quanto strettamente il substrato sia legato all enzima (affinità) Tanto maggiore sarà il valore di K M tanto più debole sarà l interazione tra substrato ed enzima

5 CONFRONTO TRA K M È la prima reazione di modificazione del glucosio una volta trasportato all interno della cellula: TAPPA FONDAMENTALE PER ogni suo impiego (in senso catabolico o anabolico) Fosforilazione del glucosio a glucosio-6-fosfato La fosforilazione del glucosio è catalizzata da una famiglia di enzimi diversi: ESOCHINASI (I, II, e III) e GLUCOCHINASI (Esochinasi IV) ESOCHINASI e GLUCOCHINASI hanno una diversa K M K M ESOCHINASI (I,II,III) = µm ( mm) K M GLUCOCHINASI = 10 mm Il legame del glucosio alla glucochinasi è da 66 a 500 volte più debole di quello all esochinasi

6 V Vmax K M ESOCHINASI = 150 µm (0.15 mm) ½ Vmax A [glucosio] > 0.7 mm l enzima è saturo: concentrazioni ancora maggiori non alterano la velocità [glucosio] mm Con questo intervallo di [glucosio] come sarà la curva per la glucochinasi (K M = 10 mm)? Per ottenere la curva della glucochinasi bisogna usare concentrazioni di glucosio maggiori V Vmax K M GLUCOCHINASI = 10 mm ½ Vmax Per saturare l enzima bisogna arrivare a 30mM glucosio [glucosio] mm Con questo intervallo di [glucosio] come sarà la curva per l esochinasi?

7 Che senso ha avere enzimi che catalizzano la stessa reazione, ma con K M così diverse? K M ESOCHINASI (I, II, III) = μm K M GLUCOCHINASI (ESOCHINASI IV) = 10 mm È espressa in tutti i tessuti È espressa solo nel FEGATO e nelle cellule β del pancreas La concentrazione di glucosio nel sangue (glicemia) varia da 4mM a digiuno a circa 10 mm dopo un pasto (nel circolo entero-epatico) V Vmax ½ Vmax [glucosio] mm

8 V Vmax ½ Vmax [glucosio] mm K M ESOCHINASI = mm È espressa in tutti i tessuti A digiuno l enzima lavora alla sua Vmax (saturo): aumenti di glucosio non alterano la velocità della reazione. I tessuti vengono EGUALMENTE riforniti di G6P INDIPENDENTEMENTE dallo stato nutrizionale K M GLUCOCHINASI = 10 mm È espressa solo nel FEGATO Dopo un pasto, l aumento della [glucosio] fa aumentare la velocità della reazione catalizzata dalla glucochinasi nel FEGATO, (ma NON negli altri tessuti) aumenta la fosforilazione del glucosio.

9 REGOLAZIONE ENZIMATICA L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO CONTROLLO GENICO (+/-) Viene regolata la quantità dell enzima

10 REGOLAZIONE ENZIMATICA CONTROLLO GENICO (+/-) Viene regolata l ESPRESSIONE (quantità) dell enzima a livello di trascrizione e traduzione del gene Tempo: decine di min - ore E REVERSIBILE interruttore trascrizionale: Attivazione (o inattivazione) di Fattori di Trascrizione su specifici Promotori Vmax è funzione della quantità di enzima presente K cat è chiamata numero di turnover: pari al numero di molecole di substrato convertite in prodotto nell unità di tempo (sec) per ciascuna molecola di enzima. Dimensioni = sec -1

11 V Vmax 20 E Glucosio 6-P µmol/min Vmax E K M GLUCOCHINASI = 10 mm l insulina ne stimola la trascrizione di circa 20 volte in 30 min [glucosio] mm

12 REGOLAZIONE ENZIMATICA L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO CONTROLLO GENICO (+) Viene regolata la quantità dell enzima CONTROLLO ALLOSTERICO (+/-) deriva da una molecola che si lega ad un sito diverso dal sito di legame

13 Regolazione allosterica. Gli enzimi allosterici hanno siti di legame per gli attivatori o inibitori (EFFETTORI o MODULATORI) diversi dal sito attivo del substrato enzima allosterico è in generale una proteina oligomerica che può esistere in due conformazioni (T e R) caratterizzate da bassa (T) o elevata (R) attività catalitica Enzima inattivo T effettore + effettore - Enzima attivo R Il legame con l effettore ha la conseguenza di stabilizzare una delle due conformazioni

14 Effettori allosterici sono soprattutto METABOLITI INTRACELLULARI Tra i principali modulatori allosterici ci sono gli indicatori dello stato energetico ATP/ADP/AMP NAD/NADH Citrato & acetil CoA E la CONCENTRAZIONE dei modulatori allosterici a determinare l effetto La costante di dissociazione definisce l affinità di un modulatore allosterico per il suo sito di legame sull enzima, ed ha le dimensioni di una concentrazione E + M [E] [M] [EM] EM = K d

15 REGOLAZIONE ENZIMATICA L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO CONTROLLO GENICO (+/-) CONTROLLO ALLOSTERICO (+/-) da metaboliti Per INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE (Partners; +/-)

16 STIMOLAZIONE O INIBIZIONE DA PARTE DI PROTEINE DI CONTROLLO INTERAZIONE PROTEINA-PROTEINA Partner attivatore Enzima inattivo Transizione conformazionale Attivazione di altre copie dell enzima substrati Enzima attivo prodotti

17 REGOLAZIONE ENZIMATICA L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO CONTROLLO GENICO (+/-) l enzima è prodotto solo quando serve. Viene regolata la quantità dell enzima CONTROLLO ALLOSTERICO (+/-) da metaboliti Per INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE (Partners; +/-) MODIFICAZIONI COVALENTI REVERSIBILI (+/-) Fosforilazione

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19 Lo stato di fosforilazione di molti enzimi ne regola DIRETTAMENTE l attività

20 Protein chinasi I substrati sono proteine Chinasi: fosforilazione Protein fosfatasi H 2 O Per poter avere un significato biologico la fosforilazione deve poter essere REVERSIBILE DEFOSFORILAZIONE: idrolisi del legame fosfo-estere

21 REGOLAZIONE ENZIMATICA L attività degli enzimi è regolata : CONTROLLO DA SUBSTRATO Tutti CONTROLLO GENICO CONTROLLO ALLOSTERICO metaboliti o partners proteici MODIFICAZIONI COVALENTI REVERSIBILI Fosforilazione ENZIMI REGOLATORI Catalizzano la reazione più lenta di una via metabolica e quindi controllano la velocità complessiva della via stessa. In generale sono enzimi allosterici e vengono controllati anche mediante fosforilazione e controllo genico (non tutti) COORDINAMENTO dell ATTIVITA METABOLICA