Prof. Maria Nicola GADALETA

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1 Prof. Maria Nicola GADALETA Facoltà di Scienze Biotecnologiche Corso di Laurea in Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche Biochimica e Tecnologie Biochimiche DISPENSA N. 15 ENZIMI III: Cinetica, Parametri cinetici, Effetto di T e ph, Reazioni a doppio substrato

2 La formazione del complesso ES è essenziale per l attività catalitica dell Enzima. Esso è stato il punto di partenza per: a)l elaborazione matematica che definisce il comportamento cinetico delle reazioni catalizzate dagli Enzimi; b)la descrizione teorica del meccanismo d azione degli Enzimi.

3 1. CINETICA ENZIMATICA La cinetica enzimatica studia la velocità della reazione enzimatica in funzione della concentrazione di substrato. Caratteristica delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione (Nelson & Cox IV ed.) Nel 1903 Henry per spiegare l andamento di tali reazioni aveva proposto la formazione di complessi instabili ES, EP. E + S E S E P E + P

4 Modello cinetico di Michaelis e Menten Nel 1913 Michaelis e Menten proposero un elaborazione matematica di tale cinetica che portò alla formulazione dell equazione che va sotto il nome di Equazione di Michaelis e Menten e che mette in relazione la velocità di catalisi con [S]. V 0 = V max [S] K m + [S] dove: V 0 = velocità iniziale della reazione V max = velocità massima K m = costante di Michaelis = (k -1 + k 2 )/k 1 [S] = concentrazione del substrato libero

5 Modello MM: la formulazione di MM si basa su un modello di reazione in cui, per definizione, è coinvolta una sola molecola di S: E + S k 1 k 2 E S k -1 E + P e fa le seguenti assunzioni sulle condizioni di reazione: V 0 = velocità iniziale della reazione quando P non si è ancora formato e quindi è P = 0 stadio lento della reazione è il secondo per cui V 0 = k 2 [ES] (7.10) [S] è 4-5 ordini di grandezza maggiore di [E] per cui [ES] può considerarsi costante nei primi 60 sec. [E t ] = [enzima totale] = [E] + [ES] [E] = [enzima libero] = [E t ] [ES] Vmax = k2 [Et]

6 La velocità di formazione di [ES] è la prima tappa veloce e reversibile della reazione E + S k 1 k -1 E S mentre la tappa di demolizione di [ES] è più lenta E S k 2 E + P Tappa 1. Velocità di formazione di ES = k 1 [E] [S] Velocità di demolizione di ES = k -1 [ES] + k 2 [ES] Tappa 2. In condizioni di stato stazionario (ipotesi dello stato stazionario di Brigs e Haldane), cioè quando [E] viene mescolato con un grande eccesso di S, ES rimane costante perché la sua velocità di formazione è uguale a quella della sua demolizione, per cui: k 1 [E] [S] = k -1 [ES] + k 2 [ES] Possiamo sostituire ([Et] [ES]) a [E] k 1 ([Et] [ES]) [S] = k -1 [ES] + k 2 [ES] (7.13)

7 da: Nelson & Cox

8 da: Nelson & Cox V 0 = k 2 [ES] V max = k2 [Et] Questa è l Equazione di Michaelis e Menten che è l equazione della velocità di una reazione a singolo substrato catalizzata da un enzima. Essa esprime la relazione quantitativa tra velocità iniziale (V 0 ), velocità massima iniziale (V max ) e la concentrazione iniziale di S [S] tra loro correlate da K m.

9 V 0 = V max [S] K m + [S] 6.12 (Nelson & Cox IV ed.) V max = [S] scomparso o [P] formato nell unità di tempo = misura la velocità della reazione enzimatica e l attività dell enzima in concentrazioni di S saturanti

10 L equazione di Michaelis e Menten descrive l equazione di una iperbole equilatera. Notare nella figura l ordine della velocità di reazione rispetto a [S]: a [S] bassissima, [S] al denominatore può essere trascurata rispetto a K m : V 0 = K[S] (reazione di primo ordine rispetto a [S], dipende solo da [S]). A [S] molto elevate rispetto a K m, K m può essere trascurata rispetto a [S]: V 0 = V max (reazione di ordine 0 rispetto a [S], non dipende da [S]). Nel tratto intermedio della curva l equazione è di ordine misto rispetto a [S]. da: Champe et al. V 0 = V max [S] K m + [S]

11 Parametri cinetici che caratterizzano un enzima nel modello di MM: Km (affinità per il substrato) Vmax (attività catalitica) Kcat/Km (potere catalitico)

12 1)Km= affinità di E per S La specificità o affinità di un enzima per il substrato è espressa dalla Km Quando V 0 = ½ V max sostituendo si ha: 1 V max = V max [S] 2 [S] + K m 1 = [S] [S] + K m = 2 [S] 2 [S] + K m 1 K m = [S] quando V = V max 2 K m ha le dimensioni di mmoli l -1 o mm Il valore di K m riflette l affinità di un enzima per il substrato: più alta è la Km, più bassa è l affinità dell enzima per S.

13 da: Nelson & Cox, IV ed.

14 2) Vmax = attività catalitica Vmax esprime l attività catalitica dell enzima la V max rivela il numero di reazioni catalizzate da una molecola di E nell unità di tempo In condizioni di saturazione di [E], cioè quando [S] è maggiore di 10 Km, attraverso la V max si misura l attività dell enzima: V max = k 2 [E t ] infatti la velocità massima è direttamente proporzionale alla quantità dell enzima totale V max = k 2 [E t ]; significa che per raddoppiare la velocità di una reazione catalizzata da un enzima è necessaria una quantità doppia di enzima totale

15 La misura della Vmax è importante per misurare la quantità di E presente in una liquido o in un estratto biologico, perchè la Vmax si può misurare in laboratorio al contrario di [Et]. Una unità internazionale (U.I.) di E è la quantità di E capace di trasformare una µmole di S in 1 min.

16 Nella diagnostica enzimatica Es. Vmax di un enzima nel siero di un paziente = 10 Vmax di quell enzima nell individuo normale. Ciò vuol dire che nel siero del paziente l enzima è presente in quantità 10 volte superiore a quella di un individuo normale (es. transaminasi, GOT, GPT) Nella purificazione di un enzima Es. attività specifica degli enzimi = Unità di E/mg prot L attività specifica durante la purificazione di un E deve aumentare fino a quando l E diventa puro: la strategia di purificazione, infatti, mira a scartare tutte le proteine dell estratto proteico ad eccezione della proteina che si vuole purificare.

17 ci dà una retta K M x ---- = [S] V max V max 1 1 V max = x = [S] V max K M K M da: Nelson & Cox (modificato) Questa equazione è y = a x + b per x = [S] = V = 0 V max 1 per y = = 0 V 0

18 Km e Vmax sono i parametri cinetici che caratterizzano un enzima che segue il modello MM: possono essere misurati sperimentalmente. da: Kleinsmith [E] fissa La velocità di una reazione si misura dalla quantità di substrato (S) consumato o di prodotto (P) formato nell unità di tempo in condizioni di saturazione ossia di Vmax. Le unità di misura dell attività enzimatica possono essere arbitrariamente fissate dallo sperimentatore.

19 Kcat (costante catalitica) Nel meccanismo a 2 tappe proposto da M e M, Vmax = k 2 [Et] k 2 è la costante della reazione che limita la velocità. Per reazioni a 3 tappe: E + S k 1 E S k 2 E P k 3 E + P k -1 k -2 K 3 è la costante della tappa che limita la velocità di tutta la reazione. In questo caso Vmax = k 3 [Et]. Viene definita Kcat la K della tappa che limita la velocità della reazione globale. Per cui, in condizioni di saturazione di S,si ha Vmax = Kcat [Et].

20 La Kcat è una costante di prim ordine espressa in sec. -1 detta anche numero di turnover. Kcat = numero di turnover = numero di molecole di substrato che vengono convertite in prodotto nell unità di tempo da una singola molecola enzimatica quando è saturata dal substrato (cioè quando [S] è maggiore di 10 Km). Kcat esprime l attività catalitica dell enzima (è come Vmax ma espressa in termini più generali). Per gli enzimi che seguono il modello di M e M la Kcat = k2

21 da: Nelson & Cox, IV ed.

22 3) Kcat/Km (potere catalitico) Kcat/Km, detta anche costante di specificità, esprime il potere catalitico di un enzima, ossia di quante volte l enzima aumenta la velocità della reazione non catalizzata. E un altro parametro che caratterizza l enzima e che permette di meglio confrontare il potere catalitico di più enzimi. A [S] molto bassa Km può essere diversa che a [S] più elevate. Pertanto quando S è <<< Km (vedi condizioni fisiologiche) è necessario tenere conto sia della Kcat che della Km. Poiché [S] è trascurabile e Vmax è uguale a Kcat [Et] sostituendo in V 0 = V max [S] K m + [S] si ottiene V 0 = Kcat K m [Et] [S] reazione di secondo ordine: la velocità dipende da [E t ] ed [S]; si esprime in M -1 sec -1.

23 Il limite superiore del valore di questo rapporto è imposto dalla velocità con cui i reagenti diffondono uno verso l altro in soluzione acquosa: questo limite dipende dalla velocità di diffusione che varia da 10 8 a 10 9 M -1 sec -1. Perfezione cinetica degli enzimi: catalizzano una reazione ogni volta che incontrano S: per es. anidrasi carbonica, triosofosfatoisomerasi.

24 da: Voete & Voet, II ed.

25 Ogni reazione enzimatica è caratterizzata da un optimum di temperatura La velocità delle reazioni enzimatiche oltre che dal substrato dipende anche dalla temperatura ambientale L optimum di temperatura è la risultante di due fenomeni descritta da una curva a campana:

26 La velocità delle reazioni enzimatiche è influenzata dalla temperatura La velocità di una reazione enzimatica dipende dalla temperatura (vedi costante di Boltzmann) Q 10 = parametro che indica di quante volte viene attivato un enzima se la temperatura del sistema aumenta di 10 C Q 10 ~ 2,0 Il Q 10 varia da un enzima all altro in quanto dipende dall energia di attivazione della reazione ( G ) Di solito oltre i C tutti gli enzimi si denaturano. Fanno eccezione gli enzimi dei batteri termofili che resistono a temperature superiori a 85 C (vedi Taq polimerasi)

27 Ogni reazione enzimatica è caratterizzata da un optimum di ph La velocità di una reazioni enzimatica oltre che dal substrato e dalla temperatura dipende anche dal ph ambientale L optimum di ph è anch esso la risultante di fenomeni di attivazione o di denaturazione della proteina enzimatica in funzione del grado di dissociazione degli amminoacidi importanti per la struttura e la funzione della proteina stessa. da: Nelson & Cox

28 La velocità delle reazioni enzimatiche è influenzata dal ph Curva a campana = risultante di due titolazioni che si sovrappongono Le modificaizoni di ph influenzano le proprietà ioniche (acido-basiche) di substrati (S) ed enzimi (E) e anche la conformazione di E La curva a campana varia con [S] per cui la K m degli E cambia con il ph Le curve più significative sono quelle che si ottengono quando l E è saturato da S a tutti i valori di ph Il ph ottimale di un E non coincide necessariamente con il ph del suo normale ambiente cellulare ma può essere più alto o più basso. VANTAGGIO: il ph ambientale può regolare l attività di E

29 Non tutte le reazioni seguono il modello di MM: molte reazioni cellulari sono a più substrati con cinetiche complesse. Nella cellula le più comuni sono le reazioni a 2 substrati che vengono classificate in reazioni a spostamento singolo con formazione di un complesso ternario reazioni a spostamento doppio senza formazioni di un complesso ternario da: Nelson & Cox, IV ed.

30 Reazioni enzimatiche a 2 substrati: a) Reazioni a spostamento singolo con meccanismo ordinato: i substrati si legano in modo sequenziale prima uno poi l altro in ordine preciso. Es. deidrogenasi piridiniche: MDH acido malico + NAD + acido ossalacetico + NADH + H + S 2 S 1 P 1 P 2 Reazioni a spostamento singolo con meccanismo casuale: i substrati si legano senza un ordine preciso. Es. fosfotransferasi: esochinasi glucosio + ATP glucosio 6-P + ADP S 1 o S 2 S 1 o S 2 P 1 o P 2 P 1 o P 2

31 b) Reazioni a spostamento doppio: meccanismo a ping-pong. L enzima lega il primo substrato, lo modifica e rilascia il primo prodotto. Successivamente l enzima (a sua volta modificato) lega il secondo substrato e rilascia, poi, il secondo prodotto (es. amminotransferasi). Amminotransferasi o transaminasi Enzimi che trasferiscono un NH 2 da un AA a un α cheto acido trasformandoli nell αchetoacido e nell α-aa corrispondenti. GOT glutammico-ossalacetico transaminasi = aspartatoamminotransferasi Gruppo prostetico: piridossalfosfato-piridossaminfosfato Aspartato (S 1 ) α-chetoglut. (S 2 ) E E-Aspartato E-NH 2 -Ac. ossalacetico E-NH 2 Ac. ossalacetico (P 1 ) E-NH 2 -α-chetoglutarato E-Glutammato E Glutammato (P 2 ) E = enzima-piridossalfosfato E-NH 2 = enzima-piridossamminafosfato

32 da: Nelson & Cox, IV ed.