Ibridazione in situ per mrna: tecnica e interpretazione
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- Artemisia Manca
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1 Patologia nodulare della tiroide: focus sugli approcci diagnostici Ibridazione in situ per mrna: tecnica e interpretazione Isabella Giovannoni U.O.C. Anatomia Patologica
2 Ibridazione -> appaiamento di sequenze complementari di nucleotidi. In situ -> quando viene effettuata su cellule o tessuti.
3 ISH: a cosa serve? Evidenziare la presenza e la localizzazione di specifiche sequenze di DNA o RNA in una cellula o un tessuto utilizzando sequenze complementari di nucleotidi, direttamente o indirettamente marcate. ISH per mrna indica l espressione del gene in quel tessuto/cellula.
4 Misurare l espressione di un gene significa... Dare una valutazione quantitativa della presenza di trascritti (molecole di mrna) o delle proteine codificate da quel gene nelle cellule in esame.
5 La nuova ISH : Morfologia ed espressione genica in un singolo esame:
6 Molecular detection & morphological La nuova ISH : context in a single assay Morfologia ed espressione genica in un singolo esame: nuova ISH
7 RNASCOPE TECHNOLOGY SINGOLO Rilevazione molecola in una singola cellula vs. PCR Amplificazione segnale+ Soppressione Background vs. ISH tradizionale Universale: qualsiasi genoma, gene o tessuto vs. IHC Sezioni tessuto in FFPE/criostatiche/ cellbocks Set di sonde altamente specifico reagenti di amplificazione segnale universale Strumento di lettura comune
8 Nuova ISH: Sensibilità Background Pretrattamento per smascherare l RNA target e permeabilizzare le cellule Probe specifiche doppio Z ibridizano su molecole di RNA target amplificazione tramite ibridazione sequenziale di amplificatori e sonde marcate Molecole di RNA visibili al microscopio Singole molecole di RNA possono essere quantificate
9 ZZ PROBE Apice Coda di 14-basi Sito di legame del preamplificatore: 28-basi Target Probe Set: Pool di 20 coppie Z Spaziatore Base: ~ basi Sito di legame specifico per target: ~ 50-basi RNA Target Region 1KB 20 coppie di ~50 basi 9 Rilevazione di singole molecole di RNA: amplificazione del segnale altamente specifica e robusta. Compatibile con RNA degradato: solo 3 coppie Z necessarie per il segnale.
10 Amplificazione segnale Probe marcata Amplificatori Pre-amplificatore Doppia Z Target Probes Z Z Z Z Z RNA Target Z Z Z Z
11 Amplificazione segnale Z Z Z Z Z Z X Z Z Z Z Non-specific Target 20 coppie Z x 20 amplificatori x 20 marcature 8000 molecole marcate per 1kb di regione
12 Sensibilità Metodica sensibile per il rilevamento in situ dell mrna. Specificità Meccanismo di rimozione del background incorporato in ogni sonda; Specificità aumentata. Quantizzazione Visualizzazione della singola molecola nel contesto morfologico; Analisi del contesto molecolare mediante multiplexing. Universale Qualsiasi gene di qualsiasi specie in qualsiasi tessuto; Tessuto in FFPE, criostatico e cell-blocks. Rapido Saggi: Brown, Red, Duplex, Multiplex con sonde fluorescenti; Possibilità di automazione.
13 Applicazioni RNA codificante per proteine, Pseudogeni Isoforme e Exon junction splice variant Geni Knockout Gene fusion Gene therapy target Pre-miRNA..
14 Dual ISH + IHC PDL1 mrna + CD45 protein (IHC)
15 ISH BRAF in tessuto tiroideo Jung YY et al. Pathol Res Pract Feb;211(2):
16 Mutazioni dei geni RAS e BRAF nel tumore del colon Baker AM et al. Nat Commun Dec 8;8(1):1998. doi: /s
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