MICROARRAY Esempio generico

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1 MICROARRAY

2 MICROARRAY Le tecniche di DNA microarray sono basate sulla microibridazione contemporanea di migliaia di specifici frammenti di DNA Il microarray consiste in un supporto solido recante una successione ordinata di migliaia di microscopici spot di DNA, contenenti ognuno poche picomoli di uno specifico frammento di DNA con una precisa sequenza (la sonda)

3 MICROARRAY Esempio generico Superficie di almeno 1 cm x 1 cm di spot o feature per array molecole di sonda (probe) per feature Tutte le molecole di sonda all interno di una feature hanno una sequenza identica Ogni feature ha una sequenza differente

4 MICROARRAY Le tecniche di DNA microarray sono basate sulla microibridazione contemporanea di migliaia di specifici frammenti di DNA Il microarray consiste in un supporto solido recante una successione ordinata di migliaia di microscopici spot di DNA, contenenti ognuno poche picomoli di uno specifico frammento di DNA con una precisa sequenza (la sonda) La marcatura del campione è in genere fluorescente Le diverse tecniche di microarray si possono dividere innanzitutto in base al tipo di applicazione e quindi di campione da analizzare I microarray si possono dividere in base alle tecniche con cui le sonde vengono ottenute e fissate sul supporto

5 MICROARRAY Supporto solido Deve essere di materiali duraturi, stabili ad alte temperature e a lavaggi ad alta concentrazione ionica Deve essere di materiali non porosi e consentire di ridurre al minimo il volume di ibridizzazione Il materiale non deve contribuire significativamente al background (es. deve essere scarsamente fluorescente) La superficie solida può essere plastica, vetro o silicio (gene chip) In genere la superficie è rivestita con una matrice chimica (es. epossi-silano, ammino-silano, poli-lisina, poliacrilammide) che consente il legame delle sonde

6 MICROARRAY Tipi di microarray (In base alle applicazioni ed al tipo di campione) Microarray per analisi di espressione genica: Il campione di partenza è RNA. Esso viene in genere retrotrascritto in cdna o trascritto in crna ed eventualmente amplificato. Microarray per individuazione di SNP, genotipizzazione, sequenziamento, ricerca di mutazioni: Il campione di partenza è DNA genomico, in genere frammentato ed eventualmente amplificato.

7 MICROARRAY Tipi di microarray (in base alle tecniche di sintesi delle sonde) Microarray Spottati: le sonde sono frammenti di DNA a singolo o doppio filamento pre-sintetizzati (in genere ottenuti per PCR) e successivamente depositati sul supporto e legati ad esso (in genere mediante UV-crosslinking). Nel caso di quelli per analisi di espressione, i geni sono in genere rappresentati da singoli frammenti, aventi dimensioni tra 50 e diverse centinaia di paia di basi Microarray di oligonucleotidi ad alta densità: le sonde sono set di oligomeri sintetizzati in situ sul supporto mediante un processo fotolitografico. Nel caso di quelli per analisi di espressione, I geni sono rappresentati da diversi oligonucleotidi di paia di basi

8 Microarray per l analisi dell espressione genica

9 Microarray spottato Produzione Il DNA spottato viene definito probe I probe vengono scelti sia da database (GenBank, dbest and UniGene), sia da librerie di cdna o EST, e collezioni di cloni Gli array a DNA possono essere fabbricati usando: ooligonucleotidi ( pb) ocdna amplificato I probe per array di cdna sono generalmente prodotti di PCR ( kb), ottenuti amplificando sequenze geniche mediante primers vettore specifici, e successivamente stampati come ds-cdna su vetrini in posizioni predefinite (spot)

10 Microarray spottato Produzione Gli spot (sia oligonucleotidi che cdna) sono di circa 150 mm, e sono tutti alla stessa distanza tra loro. Più di 30,000 cdnas possono essere posizionati sulla superficie di un comune vetrino da microscopio Prima dello spottaggio, il vetrino deve essere trattato in modo che esponga sulla superficie molecole con cariche positive (Es. polilisina) Le molecole di DNA che vengono depositate sul vetrino durante lo spottaggio, vengono successivamente UVcrosslinkate alle cariche positive del vetrino

11 Microarray spottato Produzione

12 Microarray spottato Produzione

13 Microarray spottato Legame competitivo L RNA estratto da tessuto o linea cellulare è utilizzato per generare il target marcato, che viene poi ibridizzato con i probe immobilizzati sul vetrino Questo tipo di tecnologia in genere prevede l ibridizzazione contemporanea su ogni vetrino di due cdna marcati, generati da due diversi campioni di RNA (confronto tra campione e controllo) L utilizzo di diverse molecole fluorescenti (Cy3 e Cy5) permette di marcare i due cdna con colori diversi; in questo modo è possibile miscelarli e ibridizzarli sullo stesso vetrino. Si parla di legame competitivo dei target ai probe

14 Microarray spottato RNA di controllo I diversi campioni di un set sperimentale devono essere ibridizzati con lo stesso controllo L RNA di controllo deve essere correlato al campione sperimentale Per esperimenti in vitro il controllo può essere RNA estratto da cellule non trattate, ecc Per campioni di pazienti, si può utilizzare l RNA del tessuto normale corrispondente Se viene analizzato un largo numero di campioni, il controllo può consistere in una miscela di tutti i campioni usati

15 Microarray spottato Numero di replicati e ibridizzazione La marcatura dei target con diverse molecole fluorescenti può produrre una differente efficienza di incorporazione. Quindi è importante avere: ola marcatura reciproca dello stesso campione con entrambi i fluorescenti orepliche dei campioni di esperimenti diversi, da utilizzare come controllo per la variabilità sperimentale opiù di una ibridizzazione: replicati su vetrini diversi Cy3- Cy5- Cy5- Cy3- Cy3- Cy5- Cy5- Cy3-

16 Microarray spottato Marcatura del target e ibridazione Sample RNA Wash Hybridisation Scan 1 Scan 2 Control RNA Image 1 Image 2 Combined image in software L RNA totale (circa 20 mg) dei due campioni da ibridizzare viene retrotrascritto e il cdna marcato rispettivamente con Cy3 (verde) e Cy5 (rosso) Controllo e campione vengono uniti in un unica miscela di ibridizzazione e il vetrino posto in camera di ibridazione overnight Il vetrino viene lavato e la fluorescenza emessa da ogni target è rilevata dallo scanner Il rapporto tra le intensità dei segnali rilevati nei due canali (R/V) rappresenta una misura dell ammontare relativo di specifici mrna in ogni campione

17 Microarray spottato Scannerizzazione del vetrino

18 Array di oligonucleotidi ad alta densità

19 Array di oligonucleotidi ad alta densità Fotolitografia Alcuni array di oligonucleotidi (GeneChip) sono costruiti utilizzando un processo di sintesi di luce-diretta chiamato fotolitografia Linker sintetici modificati con gruppi protettivi rimuovibili mediante la luce, sono legati alla superficie del vetrino. La luce viene diretta attraverso una maschera per deproteggere e attivare i gruppi selezionati. Nucleotidi protetti possono così accoppiarsi ai siti attivati

20 Array di oligonucleotidi ad alta densità Fotolitografia

21 Array di oligonucleotidi ad alta densità GeneChip

22 Array di oligonucleotidi ad alta densità Sintesi senza maschera

23 Array di oligonucleotidi ad alta densità Sintesi senza maschera

26 Array di oligonucleotidi ad alta densità Dimensioni dell array La fotolitografia permette la costruzione di array con alto contenuto di informazione E possibile ottenere feature di poche decine di μm 2 E possibile avere anche diversi milioni di feature (cioè migliaia di diverse probe) in uno spazio di meno di 2 cm 2 Ogni singolo probe è costituito da milioni di oligonucleotidi identici Un singolo array di meno di 2 cm 2 può consentire l analisi di circa 40,000 trascitti di geni umani

27 Array di oligonucleotidi ad alta densità Disegno degli array I geni sono rappresentati da diversi 25-meri: probe set Per ogni oligo che presenta un match perfetto (PM) con il trascritto, ne è presente uno identico con mismatch per una sola base in posizione centrale (MM) La presenza di un MM consente di stimare legami aspecifici e background locale e di sottrarli dal segnale di PM

28 Array di oligonucleotidi ad alta densità Marcatura del target

29 Array di oligonucleotidi ad alta densità Ibridizzazione A differenza degli array a DNA spottato, il sistema Affimetrix prevede l ibridizzazione di un singolo campione su ogni genechip

30 Array di oligonucleotidi ad alta densità La scannerizzazione del chip ci fornisce un immagine in cui il grado di ibridizzazione viene evidenziato da una diversa intensità di emissione nel rosso. La rilevazione dell immagine infatti è possibile grazie al legame alla biotina di un composto fluorescente (streptavidina-ficoeritrina) Rivelazione

31 Tecnologia Microarray Potenziali applicazioni La valutazione di profili di espressione genica, può trovare impiego in diverse applicazioni, quali: Caratterizzazione di marcatori diagnostici Classificazione molecolare di differenti sottotipi di malattia Identificazione di specifici target terapeutici Identificazione di vie di segnale regolate da geni chiave Drug discovery e studi tossicologici

32 Tecnologia Microarray Potenziali applicazioni La tecnologia degli array a DNA può essere utilizzata per due principali applicazioni: Profili di espressione genica da mrna: fornisce i livelli di espressione di determinati geni in un campione biologico Sequenziamento e genotipizzazione del DNA da DNA genomico: è possibile ottenere sequenze geniche e identificare polimorfismi

33 Tecnologia Microarray Potenziali applicazioni l utilizzo di microarray per la genotipizzazione ed il sequenziamento può trovare impiego in applicazioni, quali: Individuazione di mutazioni e riarrangiamenti genomici Ricerca di polimorfismi Ricerca di geni virali o batterici

34 Microarray per genotipizzazione e sequenziamento

35 Array per genotipizzazione e sequenziamento ANALISI IBRIDAZIONE SONDE TIPO ARRAY CNV (Copy Number Variation) SNP Sequenziam. di specifiche regioni Ricerca di specifiche mutazioni Competitiva Non compet. Non compet. Non compet. Non compet. Oligonucleotidi Cloni spottati Oligonucleotidi CGH-array GeneChip GeneChip (custom) Vari (es. APEX)

36 GeneChip Genotipizzazione e sequenziamento Ciascuna sequenza da analizzare è rappresentata da oligonucleotidi, ciascuno costituito da basi contenente tutte le possibili varianti di sequenza (sostituzioni, delezioni, inserzioni) La presenza di un polimorfismo è dato dalla presenza/assenza di segnale fluorescente in corrispondenza della sonda corrispondente

37 Analisi gain of hybridization signal Frammento (doppio filamento) da analizzare di lunghezza N Per coprire tutte le possibili sostituzioni su entrambi i filamenti saranno necessarie 8N sonde di nt Per coprire tutte le possibili delezioni su entrambi i filamenti saranno necessarie 2N sonde di nt Per coprire tutte le possibili inserzioni di lunghezza X su entrambi i filamenti saranno necessarie 2(4X)N sonde di nt

38 Analisi gain of hybridization signal Per analizzare una sequenza di 10 kb sono necessarie: 80,000 sonde per tutte le possibili sostituzioni Ulteriori 100,000 sonde per tutte le possibili delezioni di 1-5 bp Ulteriori 27,280,000 sonde per tutte le possibili inserzioni di 1-5 bp Limite del sistema: possono essere analizzate soprattutto delezioni e/o inserzioni di singoli nucleotidi.

39 Analisi loss of hybridization signal Idealmente ciascuna posizione nucleotidica bersaglio contribuisce nell ibridazione per un set di N sonde che si sovrappongono per N basi perfect match in unoligonucleotide array. In questo esempio il cambiamento nucleotidico in posizione A coinvolge nell ibridazione 25 sonde di 25bp. Sonde: oligonucleotidi perfect match

40 Analisi loss of hybridization signal SNP in omozigosi : completa perdita di segnale di ibridazione in corrispondenza delle sonde perfect match situate nell intorno dello SNP. SNP in eterozigosi: 50% perdita di segnale di ibridazione in corrispondenza delle sonde perfect match situate nell intorno dello SNP. Per coprire tutte le possibili sostituzioni su entrambi i filamenti (lunghezza N) saranno necessarie almeno 2N sonde di nt. Es. E necessario un array di 11,000 oligonucleotidi per analizzare il gene BRCA1 (5.5 kb)

41 Loss of signal Riferimento Omozigote WT A T A T PM Signal: 100% Omozigote MUT G C G C PM Signal: 0%

42 Loss of signal Riferimento Omozigote WT A T A T PM Signal: 100% Eterozigote MUT A T G C PM Signal: 50%

43 Gain of signal Omozigote WT A T A T (PM) A G T C Si No No No

44 Gain of signal Eterozigote MUT A T G C (PM) A G T C Si Si No No

45 Gain of signal Omozigote MUT G C G C (PM) A G T C Si Si No No

46 Riferimento Omozigote WT A T A T Gain + Loss (PM) A 100% G 0% T 0% C 0% Eterozigote MUT A T G C (PM) A G T C 50% 50% 0% 0% Omozigote MUT G C G C (PM) A 0% G 100% T 0% C 0%

47 Combinazione gain + loss of hybridization signal per l analisi del gene BRCA1

48 GeneChip specifico per SNPs di p53 (Combinazione gain + loss of hybridization signal )

49 Classificazione mutazioni p53 identificate mediante sequenziamento e mediante oligonucleotide microarray Mutation type Sequencing Microarray Total Single-bp substitutions Missense Nonsense Splice junction Deletion and/or insertion Single-bp deletion Multiple bp deletion Deletion and insertion Total Accuratezza singole sostituzioni: 94% con i microarray 87% con sequenziamento classico Accuratezza delezioni/inserzioni: 33% con i microarray 87% con sequenziamento classico

50 Sonde per mutazioni di CYP2D6 e CYP2C19 Genotipizzazione simultanea di 18 mutazioni conosciute che definiscono 10 alleli del gene CYP2D6 e 2 alleli del gene CYP2C19

51 Tecnologia Microarray Applicazioni cliniche Oncologia: in particolare nel settore delle leucemie questa tecnologia ha trovato buone possibilità di utilizzo in ambito diagnostico. La tecnologia Microarray è applicabile alla classificazione molecolare di leucemie e di diversi tipi di cancro. Sulla base dei differenti profili di espressione genica, si prospetta la possibilità di utilizzare gli array come strumento sia diagnostico (identificando anche nuovi sottotipi di malattia), sia prognostico (predizione risposta a terapie, rischi di recidiva, ecc ). La tecnologia microarray può trovare impiego anche nell identificazione di trattamenti individuali in accordo con il profilo di espressione genica del paziente e di nuovi target malattia-specifici per scopi di drug discovery.

52 Tecnologia Microarray Applicazioni cliniche Microbiologia: sono stati sviluppati array in grado di rilevare sequenze geniche di diversi tipi di patogeni. Array a oligonucleotidi, contenenti sequenze virali altamente conservate all interno della stessa famiglia consentono di rilevare e classificare nuove varianti virali. E proponibile l impiego di questa nuova tecnologia in diagnostica e nell identificazione di malattie di eziologia sconosciuta. Diversi studi hanno portato alla realizzazione di vari tipi di chip, il cui impiego può spaziare dalla diagnosi di infezioni batteriche (con rilevazione di geni per la resistenza ad antibiotici), agli studi sulle relazioni filogenetiche tra diversi microorganismi.

53 Tecnologia Microarray Applicazioni cliniche Farmacogenomica: studio della variazione individuale di risposta ai farmaci sulla base del corredo genetico. Alcuni polimorfismi genetici causano risposte differenti nei confronti di determinati farmaci. La tecnologia microarray può trovare impiego nello sviluppo di farmaci paziente-specifici. Microarray di SNP sono stati recentemente utilizzati anche per valutare il chimerismo dopo trapianti allogenici di cellule staminali