La tecnologia dei microarray

Транскрипт

1 La tecnologia dei microarray Introduzione per l analisi dell espressione genica: Affymetrix GeneChip spotted arrays L analisi dei dati Campi di applicazione dei microarray

2 Introduzione

3 I progetti di sequenziamento (progetti genoma) hanno permesso di identificare migliaia di geni Migliaia di geni (ed i loro prodotti, le proteine) operano in maniera simultanea e coordinata Il metodo tradizionale della Biologia Molecolare (un gene, un esperimento) risulta limitato E necessaria una tecnologia per monitorare l intero genoma: Microarrays di DNA (DNA microarray) Introduzione

4 Introduzione

5 Nucleus DNA Proteins RNA Cell membrane Intensity Normal Cell Line Genes Nucleus Proteins 500 Malignant Cell Line DNA RNA Cell membrane Intensity Genes Introduzione

6 Introduzione

7 La tecnologia dei microarray Introduzione per l analisi dell espressione genica: Affymetrix GeneChip spotted arrays L analisi bioinformatica Campi di applicazione dei microarray

8 Supporto solido (wafer di silicio o vetrino da microscopia) Migliaia di catene di DNA o di sequenze oligonucleotidiche immobilizzate sul supporto

9 C TA A G A G C G AT T C T C G C : G T : A A : T A : T G : C A : T G : C C : G

10 Probe Array Hybridized Array Detect Tagged RNA Target Fluorescent Stain

11 Esistono due tipologie di matrici a seconda delle caratteristiche della sequenza di DNA immobilizzata: matrici da sintesi in-situ (Affimetrix GeneChip ) matrici da deposizione (Stanford University)

12 Quartz wafer, single hyb Glass slide, dual hyb

13 * * * * * * 5 5µm 5 5µm Millions of identical probes/ feature ~6,500, mer oligonucleotides 1.28cm 1.28cm

14 Sintesi in-situ: chimica combinatoriale e fotolitografia

15

16

17

18

19 mrna reference sequence 5 3 Reference sequence Perfect match probe cells TGTGATGGTGGGAATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGGGTGACGAGGCC... TGTGATGGTGGGAATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGGGTGACGAGGCC Perfect... match oligo TGTGATGGTGGGAATGGGTCAGAACGACTCCTATGTGGGTGACGAGGCC Mismatch... oligo Mismatch probe cells Fluorescence intensity image

20

21

22 Sonde di cdna ( bp) o oligonucleotidi (30-70-mer) sono depositate in micro-gocce su di un supporto solido funzionalizzato (vetro) La deposizione avviene per mezzo di un sistema robotizzato Le sonde vengono ancorate covalentemente al supporto solido tramite reazione fotochimica Una volta immobilizzate, le sonde devono essere rese a catena singola per permettere l ibridizzazione dei targets

23 Il robot raccoglie i campioni dalle piastre a 96 o 384 pozzetti usate per produrre le sonde Il prelievo delle sonde e la loro deposizione sulle matrici viene effettuato attraverso un sistema di pennini La deposizione è seguita dal lavaggio dei pennini matrici pennini piastre

24 12 pennini 230 matrici 5 piastre 2 stazioni di lavaggio 1 stazione di essiccamento 2 matrici per secondo

25

26 Materiale: acciaio inox Diametro: ~ 1.5 mm (100 µm in punta) Ogni pennino raccoglie da 250 a 500 nl di soluzione Ogni pennino deposita nl di soluzione su ciascuna matrice Le gocce hanno un diametro da 100 a 150 µm I centri delle gocce sono separati da ±10 µm

27

28

29

30 Le molecole di tracciante vengono incorporate durante la trascrizione inversa da RNA a cdna I due traccianti più utilizzati sono il Cy3 ed il Cy5: Cy3 viene usato per marcare il riferimento (verde) Cy5 viene utilizzato per marcare il campione (rosso) I target marcati vengono ibridizzati sulle sonde immobilizzate sulla matrice

31

32 3XSSC HYB CHAMBER ARRAY LIFTERSLIP LABEL SLIDE SLIDE LABEL

33 La matrice ibridizzata viene pennellata con un fascio di luce laser inducendo la fluorescenza dei traccianti Gli spettri di emissione sono raccolti da uno scanner, filtrati, separati nelle due componenti ed, infine, sommati Cy3 - verde Cy5 - rosso Immagine finale

34 Il colore di ciascun spot indica la provenienza del cdna ibridizzato: verde: gene espresso nel riferimento, non espresso nel campione (gene represso) rosso: gene espresso nel campione, non espresso nel riferimento (gene indotto) giallo: gene espresso in entrambi i targets L intensità di ciascun spot è proporzionale al numero di molecole di tracciante e quindi al numero di targets ibridizzati Colore/intensità diversi espressione genica diversa

35

36 Preparazione delle sonde Numero di sonde Lunghezza delle sonde Densità delle sonde Fluorocromi 1 sonda per gene 25-mers ~ = (misura assoluta) Affymetrix GeneChip Sequenze oligonucleotidiche sintetizzate usando maschere fotolitografiche Sequenze oligonucleotidiche o frammenti di cdna depositati da un robot sonde per gene mers, frammenti di lunghezza variabile (da 100 a 1K bp) ~ (misura relativa) Spotted arrays

37 La tecnologia dei microarray Introduzione per l analisi dell espressione genica: Affymetrix GeneChip spotted arrays L analisi dei dati Campi di applicazione dei microarray

38 Bioinformatica

39 Bioinformatica

40 Bioinformatica

41 Pre-processamento dei dati controllo di qualità, normalizzazione, filtraggio Selezione di geni differenzialmente espressi quali trascritti caratterizzano un fenotipo Clustering (classificazione non supervisionata) come si raggrupano i campioni sulla base dei livelli di espressione genica Classificazione supervisionata predizione diagnotica o prognostica Reverse Engineering ricostruzione delle reti di regolazione genica Bioinformatica

42 Bioinformatica

43 Ribosomal proteins ery bio tpc4 tpc3 tpc2 nrps5 nrps3 Bioinformatica

44 Bioinformatica

45 La tecnologia dei microarray Introduzione per l analisi dell espressione genica: Affymetrix GeneChip spotted arrays Analisi dei dati Campi di applicazione dei microarray

46 Food testing Livestock diagnostics or grading Environmental testing Identity testing Agricultural biotech Individualized medicine Basic Research Human diagnostics Applicazioni

47 Applicazioni

48 Microarray Microarray AND Tumor # di citazioni (PubMed) Anno Applicazioni

49 Diagnosis Classification Prognosis Therapeutic Choice Is it benign? Which class of cancer? What are my chances? Which treatment? Applicazioni

50 ALL AML Which class of leukemia? MLL Golub, T.R., et al. Science 286: , 1999; Armstrong, S.A., et al. Nature Genetics 30: 41-47, 2002 Applicazioni

51 Applicazioni

52 MammaPrint van 't Veer LJ et al., Nature 2002, 415: Applicazioni

53 La tecnologia dei microarray Late Onset Disease Newborn Screening Chip e.g. Alzheimers Treatable Infant Conditions e.g. PKU Consumer Genetics Skills & Traits e.g. preferred smells & tastes e.g. height, perfect pitch Untreatable Infant Disease e.g. Swarey s Syndrome Applicazioni

54 Letture Nature Genetics The Chipping Forecast I II III January 1999, Volume 21 No 1s December 2002, Volume 32 No 4s June 2005, Volume 37 No 6s