La genomica funzionale come approccio innovativo nella definizione della qualità degli alimenti e nello studio della risposta a stress ambientali

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1 I nuovi approcci biomolecolari e l'analisi del rischio in sicurezza alimentare: quali problemi e quali prospettive La genomica funzionale come approccio innovativo nella definizione della qualità degli alimenti e nello studio della risposta a stress ambientali

2 Genomica funzionale: la Tecnologia Microarray Profili globali di espressione genica senza limitazione ad un singolo endpoint Possibilità di analizzare fenomeni biologici complessi Approccio funzionale innovativo che consente di aumentare i campi di indagine e il numero di informazioni ottenibili

3 Microarray: il principio capacità che ogni acido nucleico a singolo filamento ha di appaiarsi alla sequenza complementare, rispettando le regole di base A-T C-G. L RNA, estratto dai campioni di interesse, viene ibridizzato, previa marcatura con opportuni fluorocromi, alle sequenze rappresentative dei geni in esame, che possono essere deposte su supporto di varia natura. La lettura del microarray si realizza impiegando uno scanner dotato di laser in grado di eccitare i fluorocromi e misurarne l intensità della fluorescenza, fornendo quindi una analisi della relativa modulazione genica

4 Microarray, aspetti della sperimentazione Definizione degli obiettivi sperimentali Studio del disegno sperimentale e della dimensione del campione Familiarita con le procedure sperimentali Analisi statistica dei dati Interpretazione biologica dei dati

5 Nutrigenomica e trascrittomica Nell ambito della nutrigenomica, che include diversi approcci tipo omics in scienze dell alimentazione, la trascrittomica costituisce uno strumento efficace oggetto di molteplici studi in costante aumento. Restrizione calorica Obesità Attività di vitamine, minerali e fibre Effetto di catechine, flavonoidi ed erbe

6 Kato et al., Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care, 8: , 2005

7 Microarray e qualità alimentare Verifica rischi legati ai contaminanti Individuazione proprietà nutrizionali Identificazione effetti preventivi e protettivi per la salute umana.

8 Microarray e qualità alimentare Caratteristiche di qualità Palatabilità Profumo, Stagionalità Potere nutrizionale Effetti sulla salute dell alimento consumato. Caratteristiche di qualità di importanza sanitaria Sicurezza alimentare contaminanti naturali o di origine antropica catena di produzione e distribuzione Caratteristiche di qualità di importanza economica Provenienza Caratterizzazione di alimenti interessanti per la rappresentatività nell alimentazione italiana e per i possibili rischi/benefici sulla salute

9 Piattaforma Agilent Un laser SHG-YAG (532nm) e un laser a Elioneon (633nm), per eccitare i fluorocromi Cy3 e Cy5. Carosello a 48 posizioni Sistema distintivo di continua messa a fuoco automatica dei laser sul piano esatto del campione durante la scansione Software di Feature Extraction

10 Feature Extractor Localizzazione di tutti gli spot sull array (Find Spot Algorithm), provvedendo poi allo scarto dei pixel outlier (con intensità troppo alta o troppo bassa rispetto a una statistica di popolazione dell intero array). Segnalate le feature saturate (più del 50% dei suoi pixel ha un intensità oltre 65502), non uniformi e con background (BG) non uniforme che, possono poi essere eliminate nella successiva filtrazione dei dati. Normalizzazione, con il metodo LOWESS (locally weighted linear regression curve fit). Calcolo della log(ratio) dei segnali nel rosso e nel verde associando, ad ogni valore, un errore che verrà utilizzato per calcolare un p-value finale, PVlog(ratio), che testa l ipotesi che il valore delle log(ratio) non sia differente da zero (ipotesi nulla).

11 Normalizzazione Rendere confrontabili i campioni etichettati con Cy3 e Cy5 ed ibridati congiuntamente su un singolo microarray. Eliminare errori sistematici dovuti a: diversa quantità di mrna associata ad ogni marcatore diversa efficienza di incorporazione dei due marcatori diversa intensità di radiazione emessa dai due marcatori differentemente misurata dal tubo fotomoltiplicatore differenti intensità misurate in diverse parti del microarray a causa del posizionamento non perfettamente orizzontale del microarray rispetto al laser dello scanner differenze tra gruppi di spot creati da differenti penne L algoritmo si basa sull ipotesi che la mediana del rapporto delle intensità di tutte le feature sia zero.

12 Interferenti Endocrini : Tamoxifen L'antiestrogeno non steroideo tamoxifen (TAM), utilizzato da una ventina d'anni nella terapia adiuvante e palliativa del tumore della mammella. Effetti collaterali della molecola con insorgenza di tumori dell'endometrio ed evidenze sperimentali nell'animale e in vitro a sostegno di una attività mutagena e di effetti promoventi esercitati da questo antiestrogeno.

13 Studio degli effetti di TAM sulle U87 Glioblastoma-Astrocitoma GRADO III Studi funzionali: Test di vitalità Curva di proliferazione Crescita in agar Test di apoptosi E-screen Espressione ER Studio preliminare di espressione genica: Analisi in microarray: NTvsTAM 9µM (GI50) NTvsTAM 15µM (TGI)

14 Esperimento preliminare microarray Sono stati utilizzati vetrini Agilent Human 1A Oligo DNA Microarrays. Ogni array comprende oligonucleotidi 60-mer rappresentativi di geni umani appartenenti al Genomics Foundation Database della Incyte NTvsTAM 9µM (GI50) - NTvsTAM 15µM (TGI) Solo i geni ottenuti dalla Feeature Extraction con un significatività per la log(ratio) minore di 0,01 sono stati selezionati per la successiva analisi GoMiner, un tool di interpretazione biologica dei dati di microarray, disponibile in rete. Questo programma organizza la lista di geni modulati nel contesto di Gene Ontology (GO), un database che contiene una classificazione dei geni in categorie gerarchiche basate su processo biologico, funzione molecolare e compartimento cellulare. GoMiner opera confrontando due liste di geni, e una che riporta i geni significativamente modulati

15 Classi di geni modulati dal trattamento con TAM 9µM Fattore arricchimento R e = (geni variati in una classe/geni totali nella classe) (geni variati nel chip/geni totali nel chip) R e * ** ** ** * 1 0 Development Extracellular Cell Adhesion Molecule Activity Defence/Immunity Protein Activity Signal Transducer Activity Biological process Cellular component Molecular Function

16 Classi di geni modulati dal trattamento con TAM 15µM Fattore arricchimento R e = (geni variati in una classe/geni totali nella classe) (geni variati nel chip/geni totali nel chip) 5 4 R e * * * 0 Extracellular Obsolete Transporter Activity Cellular component Molecular Function

17 Time-course tamoxifen:disegno sperimentale T 0 U87 TAM 20µM Vetrini Agilent Human 1A (V2) oligo DNA microarray 30 2 h 4 h 6 h 16 h 24 h

18 Package Maanova di R Una tipica analisi di dati che utilizza gli strumenti disponibili nel package può essere suddivisa in quattro fasi principali: I. operazioni di prefiltraggio dei geni: (spot saturati e di controllo) II. elaborazione preliminare dei dati grezzi: (operazioni di trasformazione utili alla normalizzazione interna dei microarray e quella necessaria a rendere i dati adatti ad un modello lineare) III. fit del modello lineare ai dati: nel modello l effetto d interesse è l interazione tra la varietà (nel nostro caso le varietà sono sei cioè i tempi di trattamento) e il gene IV. test statistici: (nel package sono disponibili quattro diversi test statistici. Questi test differiscono sulla base di come viene stimata la varianza associabile al livello di espressione di ciascun gene di una data varietà)

19 Geni modulati da TAM in cellule U87 Regolazione delle interazioni cellulamatrice Alterazione delle componenti citoscheletriche Controllo del ciclo cellulare: fase G1/S Controllo del ciclo cellulare: fase G2/M Controllo della trascrizione Controllo dei sistemi di riparo del DNA Controllo dell apoptosi

20 Considerazioni finali La maggior parte dei geni differentemente espressi indotti dal trattamento con tamoxifen, fino ad ora analizzati, ha interessato elementi coinvolti in vari pathway biologici fra cui il controllo del ciclo cellulare (checkpoint in G1/S e G2/M), la regolazione trascrizionale, il processo apoptico e le interazioni cellulamatrice L alterata espressione genica, valutata nell esperimento di time-course, ha individuato alcuni dei probabili geni candidati biomarkers che sottendono la risposta a tamoxifen nel nostro sistema cellulare di astrocitomaglioblastoma

21 estratti da matrice PROGETTO MITICA Triennale Multicentrico Differenti matrici Contaminanti PCB Diossine Triazoli Micotossine Tecnologie LC/MS Microarray Proteomica PCB caratterizzazione chimica diossine triazoli micotossine batteri genomica funzionale valutazione biologica caratterizzazione molecolare cellule proteomica

22 Fonte PCB Suolo estratto Caratterizzazione chimica Test biologici e molecolari PROGETTO ARCADE Biennale ARPA-ER Differenti matrici Contaminanti PCB Metalli Pesanti Diossine Tecnologie LC/MS Trasformazione cellulare Comunicazioni GJ Microarray Acqua Crostacei Mitili estratto estratto PCB Metalli Pesanti Biotossine estratto Caratterizzazione chimica Test biologici e molecolari Caratterizzazione chimica Test biologici e molecolari Caratterizzazione chimica Test biologici e molecolari

23 Fattori ormonali potrebbero essere necessari per mediare gli effetti antiossidanti del licopene

24 falcarinolo falcarindiolo ac. clorogenico eugenolo naringenina ac. gentisico 24-metilene cicloartenolo quercetina ac. p-cumarico kempferolo vaniglina lanosterolo Licopene rutina

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26 FATTORI AMBIENTALI Genomica&Qualità ARPA ER AUSL BO Principi Attivi Principi Attivi TEST BIOLOGICI TEST BIOLOGICI GENOMICA FUNZIONALE GENOMICA FUNZIONALE VALUTAZIONE RISCHIO-BENEFICIO