DESCRIZIONE DEI DIFFERENTI METODI MOLECOLARI DISPONIBILI PER LA RILEVAZIONE DI HPV E L L IDENTIFICAZIONE DEI GENOTIPI

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1 DESCRIZIONE DEI DIFFERENTI METODI MOLECOLARI DISPONIBILI PER LA RILEVAZIONE DI HPV E L L IDENTIFICAZIONE DEI GENOTIPI Relatore:Paola Alberizzi-TLBM Responsabile:Dr.ssa Barbara Dal Bello

2 INTRODUZIONE L HPV (VIRUS DEL PAPILLOMA UMANO)E RICONOSCIUTO COME LA CAUSA PRINCIPALE DELLO SVILUPPO DEL CANCRO DELLA CERVICE; STUDI EPIDEMIOLOGICI EVIDENZIANO CHE CIRCA 80-90% DEI CARCINOMI DELLA CERVICE CONTENGONO DNA DI HPV. (Boshart et al.1984)

3 BIOLOGIA DEL PAPILLOMA VIRUS: E UN VIRUS A DOPPIA ELICA CIRCOLARE DI DNA; DIAMETRO: 500 nm

4 STRUTTURA DELL HPV

5 STORIA NATURALE DELL INFEZIONE DA HPV

6 INTEGRAZIONE DELL HPV E TRASFORMAZIONE ONCOGENA Se il DNA del virus rimane nel nucleo in forma extracromosomica questo da origine a prolifearzioni benigne quali verrucche o condilomi Se il DNA del virus si INTEGRA nel genoma della cellula ospite questo da origine ad alterazioni della struttura e crescita delle cellule fino alla formazione di una neoplasia!!

7 Integrazione

8 HPV e genotipi IL POTERE ONCOGENO E ASSOCIATO AD ALCUNI TIPI HPV; DEGLI OLTRE 60 TIPI DIFFERENTI 20 SONO IMPLICATI NELLO SVILUPPO DELLE LESIONI GENITALI; TRA I 20 TIPI VIRALI DI HPV ASSOCIATI A TUMORI MALIGNI I PIU FREQUENTI SONO 16 E 18. (DeVilliers)

9 TEST DI LABORATORIO NELLA RICERCA E TIPIZZAZIONE DEL VIRUS PAPILLOMA

10 I TEST SONO MOPLTEPLICI E CON CARATTERISTICHE ESTREMAMENETE VARIE DI: COMPLESSITA COSTO APPLICABILITA SU MATERIALE BIOLOGICO LIVELLO DI AUTOMAZIONE ACCURATTEZZA

11 SI POSSONO DIVIDERE IN DUE GRUPPI: TEST AD APPROCCIO IMMUNOISTOCHIMICO TEST AD APPROCCIO MOLECOLARE

12 METODO IMMUNOISTOCHIMICO PREVEDE L USO DI ANTICORPI MONO O POLICLONALI IN GRADO DI REAGIRE CON ANTIGENI PRESENTI NEL CAPSIDE VIRALE PREVEDE L UTILIZZO DI MATERIALE CITOLOGICO FRESCO O FISSATO

13 PROCEDURA

14 LA METODICA PU0 ESSERE SUDDIVISA NELLE SEGUENTI FASI: 1 FASE DI FISSAZIONE E DI BLOCCO DELLE PEROSSIDASI ENDOGENE 2 INCUBAZIONE con l Ac. primario contro gli antigeni del capside 3 FASE DI RIVELAZIONE con Ac. biotinilati che si legano all Ac. primario 4 FASE DI SVILUPPO con specifici cromogeni 5 FASE DI CONTROCOLORAZIONE con ematossilina

15 I nuclei in cui è presente il DNA hanno una colorazione rosso-bruna Fig istologia

16 LIMITI DELLA METODICA NON PERMETTE UNA PRECISA ATTIVITA TERAPEUTICA E PROGNOSTICA NON PERMETTE INDICAZIONI PRECISE RIGUARDO : ESISTENZA GRADO DI REPLICAZIONE ATTIVITA DEL VIRUS

17 METODI MOLECOLARI QUESTI METODI PREVEDONO L UTILIZZO DI TECNICHE ATTRAVERSO LE QUALI SI METTE IN EVIDENZA IL GENOMA VIRALE, IL DNA.

18 IL DNA PUO ESSERE IDENTIFICATO TRAMITE 1. IDENTIFICAZIONE DIRETTA: 1a. IBRIDAZIONE in SOLUZIONE (Hybrid Capture) 1b. SOUTHERN BLOT 2. AMPLIFICAZIONE ENZIMATICA MEDIANTE THERMAL CYCLER (PCR)

19 1-IDENTIFICAZIONE DIRETTA 1a-IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE E APPICABILE SIA SU PREPARATI ISTOLOGICI SIA SU STRISCI; PERMETTE LA DETERMINAZIONE DEL DNA VIRALE E DI 13 GENOTIPI AD ALTO RISCHIO;

20 PRINCIPIO: REAZIONE TRA IL DNA DI HPV CON SPECIFICI PROBES A RNA ; SE IL DNA DI HPV E PRESENTE SI FORMERANO DEGLI IBRIDI RNA/DNA ; QUESTI IBRIDI VERRANNO CATTURATI IN UNA FASE SOLIDA (MICROPIASTRA) DA ANTICORPI UNIVERSALI; IL RILEVAMENTO E EVIDENZIATO CON UN SUBSTRATO CHEMILUMINESCENTE

21 METODO

22 1b-SOUTHERN BLOTTING E STATO IL PRIMO METODO UTILZZATO NELLO STUDIO DEL DNA HPV E APPLICABILE SU CELLULE E BIOPSIE

23 PRINCIPIO FRAMMENTI DI DNA GENERALMENTE OTTENUTI DA UNA DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE VENGONO SEPARATI SU DI UN GEL D AGAROSIO, TRASFERITI AD UNA MEMBRANA DI NITROCELLULOSA E SUCCESIVAMENTE IBRIDATI CON UNA SONDA MARCATA CHE EVIDENZIA IL DNA DI INTERESSE

24 METODO

25 2-L AMPLIFICAZIONE ENZIMATICA E UN METODO RECENTE, INTRODOTTO NEL 1985; E APPLICABILE SU CELLULE E BIOPSIE.

26 PRINCIPIO PERMETTE DI AMPLIFICARE FINO A10 8 UNA SEQUENZA SPECIFICA DI DNA UMANA, VIRALE, BATTERICA; L AMPLIFICAZIONE AVVIENE: -PER MEZZO DELL ESTENSIONE DI DUE PRIMERS, LOCALIZZATI DA UNA PARTE E L ALTRA DELLA REGIONE CONSIDERATA -PER L AZIONE DI UNA DNA POLIMERASI

27 METODO

28 Termociclatore

29 TIPI DI PRIMERS UTILIZZATI AUTORI PRIMERS REGIONE LUNGEZZA FRAMM. MANOS MY09/MY11 L1 400 bp 1989 SNIJDERS GP5+/GP6+ L1 200 bp 1990 KLETER SPF10 L1 65 bp 1998

30 IDENTIFICAZIONE TIPO- SPECIFICA GEL D AGAROSIO: il prodotto di amplificazione e analizzato con elettroforesi su di un gel di agarosio al 2% in tampone TAE 1X (Tris-acetato 0.04M, EDTA 10mM, ph 8), colorato con etidio bromuro (0.5 mg/ml) e quindi fotografato in luce ultravioletta: IBRIDAZIONE INVERSA (LIPA, Line probe assay), identifica i DNA amplificati mediante selettiva con oligonucleotidi immobilizzati su membrana

31 PRODOTTI DI PCR con primers My09/My11 e GP5 + /GP6 + My09/My11 GP5 + /GP6 +

32 Tecnologia LiPA Ibridazione inversa: : principio Cromogeno (NBT/BCIP) Precipitato viola Fosfatasi alcalina 3 5 Streptavidina Biotina Target amplificato Sonda a DNA Striscia di Nitrocellulosa

33 LiPA product INNO-LiPA HPV genotyping CE consente l identificazione di 16 tipi dihpv 11 tipi ad alto rischio: 16, 18, 31, 33, 45, 51, 53, 58, 59, 66, 68 5 tipi a basso rischio: 6, 11, 40, 54, 70 Nella striscia LiPA sono presenti tutti I genotipi inclusi nel vaccino Gardasil (Sanofi Pasteur MSD): HPV 6, 11, 16, and 18, e nel vaccino Cervarix (GlaxoSmithKline): HPV 16 and 18.

34 SENSIBILITA METODI MOLECOLARI PCR IIBRIDAZIONE IN SITU SOUTHERN BLOTTING

35 Grazie a tutti per l attenzione l e e