TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. Dott.ssa Francesca Santilli

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1 TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE Dott.ssa Francesca Santilli

2 Sin dai primi anni 60, i biologi molecolari hanno scoperto come caratterizzare, isolare e manipolare le componenti molecolari delle CELLULE e degli ORGANISMI: DNA, il depositario dell'informazione genetica; l'rna, che funge da copia temporanea operativa di DNA e le PROTEINE, che ricoprono ruoli strutturali ed enzimatici nelle cellule.

3 Elettroforesi

4 Elettroforesi su gel Metodo per separare le molecole (DNA, RNA, proteine, etc.) sulla base di proprieta fisiche o chimiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica elettrica

5 Elettroforesi di Proteine Piu complessa dell elettroforesi di DNA l Proteine diverse hanno cariche diverse l Le proteine variano molto per forma Generalmente il gel e fatto di poliacrilammide

6 Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? I gel di poliacrilammide hanno una trama piu compatta I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu piccole del DNA l l Amminoacido medio = 110 Da Paio di nucleotidi medio = 649 Da l l 1 kilobase di DNA = 650 kda 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kda

7 Elettroforesi di proteine Condizioni Non Denaturanti Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle proteine prima dell elettroforesi l l l Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2 e 3 ; legami disolfuro covalenti) Le proteine conservano la loro carica normale Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma

8 Elettroforesi di proteine Condizioni denaturanti Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell elettroforesi (SDS-PAGE) l Le molecole di SDS si legano alle proteine l Le proteine perdono la loro normale forma l Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa l Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni

9 SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) CH 3 SDS (Sodio Dodecil Solfato) l Solubilizza e denatura le proteine l Aggiunge cariche negative alle proteine CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O O S O - O SDS

10 Proteina Nativa Carica netta: -4 Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-)

11 Come funziona un Gel SDS-PAGE? Le proteine cariche negativamente si muovono verso l elettrodo positivo s-s SDS, calore Proteine con SDS Proteine piu piccole si muovono piu velocemente Le proteine si separano per dimensione +

12 CAMPIONI PROTEICI Estratti di tessuti o cellule Proteine ricombinanti etichettate con antigeni ( tags : HA, T7) Virus interi purificati Localizzazione cellulare (nucleo, membrana, citoplasma)

13 Estrazione delle proteine Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari l Concentrazione dei sali l Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) l ph l Inibitori di proteasi l Bassa temperatura (ghiaccio) Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF

14 Cosa c e nel tampone di caricamento? Un tampone (Tris) per fornire il giusto ph (6,8) SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica negativa complessiva Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere nei pozzetti Un agente riducente (DTT o b-mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni

15 SDS-PAGE acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1% Colorazione con Blu di Coomassie

16 Sistemi per la corsa di SDS-PAGE Piccolo (8 x 10 cm) Medio (16 x 16 cm)

17 Il Gel Come funziona: l STACKING GEL: 4-5% gel superiore, ph 6.8 RUNNING GEL: 8-14% gel separatore, ph 8.8 l Le molecole di acrilammide sono tenute assieme dalla bis-acrilammide, formando una struttura a lattice l Polimerizzazione piu rapida aggiungendo catalizzatori: TEMED e APS

18 Il Gel Componenti del gel SDS-PAGE Soluzione di Acrilammide/Bis-Acrilammide Tris-HCl ph 6.8 oppure Tris-HCl ph 8.8 SDS ddh2o TEMED APS (ammonio persolfato) Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS)

19 Come funziona: l Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente elettrica l l l Includere un marker di peso molecolare colorato 10-50ug di estratto proteico totale 0.1-1ug di proteina purificata l Ioni Cloruro (-) / Proteina / Glicina (+) l Si muovono verso il gel separartore ( resolving) l Differenze di ph causano la ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore Stacking ph 6,8 Resolving ph 8,8 +

20 Il Gel % di acrilammide consigliata Dimensioni delle proteine 8% 10% 12% kda kda kda

21 Visualizzazione delle proteine nel gel I due metodi piu usati sono: Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con l argento Silver staining (puo essere visualizzato ~1ng di proteina per banda) Coomassie staining Silver staining

22 Stima dei pesi molecolari kd mm Dimensioni in kda Distanza (mm dal pozzetto)

23 Western Blotting

24 BLOTTING (TRASFERIMENTO) Molecole trasferite Sonda Gel Southern DNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide Northern RNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide Western Proteine Anticorpi Acrilammide

25 Cosa e un Western Blot? Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo.

26 A cosa serve il Western Blot? Qual e la proteina che mi interessa? l SDS-PAGE (non certo) l Si basa sul confronto di peso molecolare l Western blot (certo) l Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo? +

27 Fasi di un Western Blot Prima fase: elettroforesi su gel. (Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico) Terza fase: saturazione o blocking. (La saturazione e usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l anticorpo e la membrana)

28 Fasi di un Western Blot Quarta fase: legame dell anticorpo primario. (L anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) Quinta fase: legame dell anticorpo secondario. (L anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l anticorpo primario, gia legato alla proteina sulla membrana) Sesta fase: rivelazione o detection. (L enzima coniugato all anticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

29 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Le proteine nel gel sono ancora in soluzione l Le bande diffondono e si confondono col tempo E necessaria l immobilizzazione per: l l Preservare in maniera permanente l esperimento di elettroforesi Permettere il riconoscimento di proteine specifiche La strategia piu comune e il trasferimento su membrana l l Fatta di Nitrocellulosa, PVDF (Polivinilidene fluoride) o nylon Si usa l elettroforesi, in un processo detto blotting

30 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento membrana

31 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Elettroblotting l Apparato di trasferimento l Il gel e messo tra strati di carta da filtro con la membrana a diretto contatto col gel sul lato verso l elettrodo positivo l Viene applicato un campo elettrico e le proteine migrano fuori dal gel verso l elettrodo positivo e si legano alla membrana l Fatto a 4 C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine

32 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Trasferimento dal catodo (-) all anodo (+) 1) Spugnette 2) 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento 3) Gel 4) Membrana 5) 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento 6) Spugnette

33 Western blot: terza fase saturazione o blocking Per saturare i siti idrofobici liberi sulla membrana Per prevenire il legame dell anticorpo primario alla membrana stessa Latte scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA)

34 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario L anticorpo primario riconosce la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate sulla membrana Anticorpi come sonde: l Molto sensibili l Possono essere prodotti l Immunizzando una specie diversa (anticorpi policlonali) l Generando anticorpi monoclonali (mab)

35 Anticorpi Ab + Ag Kd AbAg Kd = [Ab] = 10-9 M [AbAg]

36 Anticorpi Anticorpi (immunoglobuline, Ig) Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in risposta ad uno specifico antigene, come un batterio o un virus, che neutralizza l antigene legandosi specificamente ed esso e producendo una risposta immunitaria.

37 Anticorpi monoclonali Gli anticorpi monoclonali sono un insieme di anticorpi identici fra loro, prodotti da un solo tipo di cellula immunitaria. In un animale da laboratorio, normalmente un topo, si induce la risposta immunitaria verso un antigene specifico. Una volta verificata l avvenuta stimolazione della risposta immunitaria, vengono prelevati i linfociti B del topo immunizzato e queste cellule vengono poste in coltura con cellule derivanti da un tumore del sangue murino (un mieloma), non producente anticorpi. Le condizioni di coltura sono tali da favorire la fusione tra i linfociti e le cellule di mieloma. RICONOSCONO SOLO UN EPITOPO

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39 Anticorpi policlonali è una miscela di anticorpi ottenuti dall'immunizzazione di un animale (attraverso iniezione sottocutanea, intramuscolare o endovenosa) con un antigene. Gli anticorpi che risultano da questa immunizzazione saranno geneticamente diversi (perché prodotti da plasmacellule diverse) e ognuno di essi riconoscerà un epitopo diverso dello stesso antigene. Immunizzazione ripetuta dell animale con l antigene (peptide, proteina purificata o ricombinante) Il sangue e prelevato nel momento di picco di produzione dell anticorpo ed e purificato il siero Il pool degli anticorpi riconosce molti epitopi dell antigene usato per l immunizzazione

40 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario

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42 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

43 Anticorpi Anticorpo primario l Riconosce la proteina Anticorpo secondario l l l l l Lega l anticorpo primario Generalmente prodotto in una specie diversa Coniugato con un enzima Il substrato dell enzima sara convertito in un prodotto colorato Puo anche essere radioattivo o fluorescente

44 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

45 Western blot: sesta fase rivelazione o detection Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) l Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato Substrati Chemioluminescenti l Emettono luce se convertiti dall enzima l Possono essere visualizzati su lastre radiografiche Marcatura radioattiva Anticorpi secondarii biotinilati

46 Western blot substrato HRP HRP luce Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce pg proteina