Elettroforesi. Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico

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1 Elettroforesi Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico

2 Principio: Migrazione di particelle cariche sotto l azione di un campo elettrico. Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA. Forza elettrica : F el = q E Forza frizionale : F fr = f v (f = 6 r ) Quando le forze si bilanciano: q E = f v q v = E f v q mobilità elettroforetica : = = E f

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4 Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule: V = R I W = R I 2 Operare a I costante Dissipare l eccesso di calore

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6 Acidi nucleici

7 ELETTROFORESI SU SUPPORTO su carta su gel

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9 Gel di agarosio Elettroforesi orizzontale

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11 Formazione di un gel di poliacrilammide CH 2

12 Acrilamide, bisacrilamide monomeri Ione perossodisolfato iniziatore TEMED catalizzatore L ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione

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14 La mobilità elettrofoertica risulta inferiore a quella che ci si aspettera Effetto setaccio del supporto di separazione Grafico di Ferguson: Mobilità elettroforetica in funzione della concentrazione del gel

15 Effetto setaccio in un gel uniforme

16 MOBILITA ELETTROFORETICA ED EFFETTO SETACCIO MOLECOLARE Se q L, in assenza di gel e pressoché indipendente dalle dimensioni molecolari

17 Migrazione di proteine e DNA in gel di varia porosita

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20 Visualizzazione del DNA: etidio bromuro luce UV

21 Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità proporzionale all inverso del log 10 del peso molecolare, facendo migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso molecolare del campione ignoto x pozzetti distanza in cm dai pozzetti

22 Utilizzando una serie di frammenti di DNA a peso molecolare noto è possibile costruire una curva di taratura. Ogni banda corrisponde ad un punto le cui coordinate sono costituite, in ascissa, dalla distanza in cm dal pozzetto e, in ordinata, dal Log 10 del peso molecolare. Congiungendo tutti i punti, riportati su un grafico semi-logaritmico, si dovrebbe formare una linea approssimativamente retta, da cui, nota la distanza dal pozzetto percorsa da una banda incognita, è possibile estrapolare il peso molecolare approssimativo X=log 10 0, , , X 10 0,54 = Kb 3, Distanza in cm dal pozzetto

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32 Per semplificare l analisi di miscele di proteine è possibile fare in modo che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensioni delle catene polipeptidiche. Ciò si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Solfato (SDS). Tale detergente si lega con forza alle proteine, le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS. In media, ogni due amminoacidi sarà presente una molecola di SDS. Poiché ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di ph adoperati per l elettroforesi, la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite sarà molto più negativa di quella delle catene non rivestite. Inoltre il rapporto carica/massa sarà essenzialmente identico per proteine diverse, dal momento che il rivestimento di SDS domina la carica. La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente si baserà quasi esclusivamente sulle dimensioni delle molecole proteiche

33 Sodio Dodecil Solfato CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 OSO 3 - Na + proteina

34 Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela è essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli La parte superiore del gel di poliacrilammide, nota come stacking gel, è versata direttamente al di sopra del resolving gel Lo stacking gel ha delle proprietà che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolving gel in maniera efficace e riproducibile Lo stacking gel è polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide, per assicurare un alta porosità, ed è tamponato con tampone Tris-HCl a ph 6,8 Il resolving gel contiene invece una percentuale più alta di acrilammide ed è tamponato con Tris-HCl a ph 8,8 Il tampone di corsa contiene Tris a ph 8,3 con glicina come controione

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41 Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stacking gel a ph 6,8 sarà principalmente nella sua forma zwitterionica neutra, con una piccola frazione (1%) in forma di ione glicinato carico negativamente Ciò impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente Gli ioni Cl - restano trasportatori efficienti di corrente a ph 6,8 e migrano rapidamente verso l anodo Durante questa elettroforesi nello stacking gel, la concentrazione degli ioni Cl - scende drasticamente all estremità catodica del gel, formando un gradiente crescente di concentrazione verso l anodo Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante, i quali hanno rapporti carica/massa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -, devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl - e davanti alla glicina A mano a mano che procede l elettroforesi, le molecole proteiche che raggiungono il resolving gel sono ritardate notevolmente, consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerle Il volume del campione di proteine presentato al gel di risoluzione sarà molto più piccolo del volume caricato inizialmente sullo stacking gel

42 Quando viene applicata la corrente, tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocità altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico. Perché ciò avvenga è necessario che gli ioni glicinato, più lenti, siano soggetti ad un campo elettrico più intenso rispetto agli ioni Cl - più veloci. Il campo elettrico è inversamente proporzionale alla conduttività, la quale a sua volta è proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente. Il risultato è che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl - siano più concentrati dei complessi SDSproteina, i quali, a loro volta, siano più concentrati del glicinato. Dal momento che la quantità di complessi SDS-proteina è molto inferiore alla quantità di ioni glicinato, questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl -.

43 Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione, per effetto del ph più alto (6,8 nello stacking gel e 8,8 nel resolving gel), diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilità Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl - migrano più velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina, i quali migrano in maniera inversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel Le proteine più piccole passano più facilmente all interno dei pori del gel, mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

44 SDS-PAGE (Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare

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48 SDS-PAGE : elettroforesi discontinua Le tre specie ioniche aggiustano la loro concentrazione in modo che [Cl ] > [proteina-sds] > [glicinato]. Poiché la quantità di proteina-sds e molto piccola, questa specie si concentra in una banda molto stretta fra la banda del glicinato e quella del Cl.

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51 Colorazione con Coomassie COLORANTI ASPECIFICI Colorazione con nitrato di Ag Si possono effettuare valutazioni quantitative delle bande proteiche col densitometro: misurazione della luce trasmessa quando un raggio luminoso è fatto passare attraverso il gel colorato. Si hanno picchi di assorbimento di cui si può calcolare l area che è proporzionale alla quantità di proteina

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54 Applicazioni della SDS-PAGE Purezza del campione Determinazione del PM Western blot Purificazione della proteina

55 Applicazioni dell SDS-PAGE Determinazione del PM

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57 Western blotting

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60 Tecniche di analisi Elettroforesi capillare Elettroforesi Altissimo potere risolutivo. Capillare di silice riempito con elettrolita. Si usano campi elettrici elevati perché il capillare disperde bene il calore. Si usa soprattutto in Biochimica clinica per dosare le proteine del siero e le emoglobine patologiche. M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

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62 Tecniche di analisi Elettroforesi Elettroforesi di proteine

63 Tecniche di analisi Zimogramma Elettroforesi Il colore del fondo si forma solo in presenza di superossido, dove c è l enzima la colorazione non si forma M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

64 Tecniche di analisi Elettroforesi Densitometria M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

65 Tecniche di analisi Densitometria: relativa or assoluta Elettroforesi M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

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72 Tecniche di analisi Elettroforesi

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74 Tecniche di analisi Elettroforesi Tecnica molto usata in diagnostica molecolare per discriminare varianti proteiche prodotte da geni mutati. M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

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78 Tecniche di analisi Elettroforesi

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81 Tecniche di analisi Proteomic Analysis

82 Tecniche di analisi Proteolytic digestion Sample 2D electrophoresis Pure protein Proteolytic fragments Mass spectrum MALDI-TOF Capillary Electrophoresis HPLC GCG Database searching N- LC/MS/MS Amino acid sequencing Juang RH (2005) BCbasics

83 Tecniche di analisi Unknown protein Protease digestion P1 P2 P3 P4 MALDI-TOF Search Database Candidate protein Digestion Simulation m/z Calculate Mol wt MW4 MW2 MW3 MW1 MW4 MW2 MW3 MW1 Compare peptides and identify the unknown protein Juang RH (2004) BCbasics

84 Tecniche di analisi Unknown protein Phosphorylated protein Protease digestion Protease digestion P1 P2 P3 P4 P1 P2 P3 P4 LC LC P ESI-Mass/Mass P4 P P4 ESI-Mass/Mass G K G S W V -GKGSWVR R Phosphorylation site Direct sequencing Juang RH (2004) BCbasics

85 Elettroforesi delle proteine plasmatiche

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