Purificazione delle proteine

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1 STUDIO DELLE PROTEINE Purificazione delle proteine 1. cromatografia 2. determinazioni quantitative concentrazione 3. elettroforesi 4. determinazione della massa

2 STUDIO DELLE PROTEINE Purificazione delle proteine 1. Cromatografia: Gel filtrazione Scambio ionico Interazioni idrofobiche Affinità

3 Principi della separazione cromatografica La separazione delle macromolecole e in particolare delle proteine in cromatografia si basa sull equilibrio di ripartizione tra: una FASE MOBILE, costituita dal solvente nel quale è presente la miscela di proteine e contaminanti una FASE STAZIONARIA (associata ad un supporto o MATRICE), che può avere caratteristiche differenti (carica, idrofobicità, presenza di liganti specifici, porosità ), in modo tale da consentire l interazione selettiva e preferenziale di alcune macromolecole o proteine rispetto ai contaminanti e consentirne così la purificazione. Coefficiente di ripartizione R=C S / C M dove C S corrisponde alla concentrazione della proteina di interesse nella fase stazionaria e C M nella fase mobile

4 Quale tecnica cromatografica? Criteri di scelta

5 Schema del processo H A: tampone di eluizione B: miscelatore o formatore di gradiente C: sistema di pompaggio D: colonna cromatografica E: rivelatore F: plotter per cromatogramma G: raccoglitore di frazioni H: rubinetto a tre vie o loop di iniezione

6 Matrici per CROMATOGRAFIA La matrice è il substrato solido della fase stazionaria. La matrice può essere modificata tramite reazioni chimiche per coniugare gruppi con differente funzionalità: Es. gruppi carichi positivamente o negativamente - metalli (zinco, rame, nichel) - molecole idrofobiche (C4-C18) -ligandi specifici (coenzimi, anticorpi) Uno stesso gruppo funzionale può essere coniugato a differenti matrici, che conferiscono diverse caratteristiche chimico-fisiche.

7 Cellulosa: Dettaglio matrici cromatografia E un polisaccaride lineare, formato da MONOMERI di GLUCOSIO con legame β 1-4. [figura 1]. La presenza di 3 GRUPPI IDROSSILICI per monomero rende la matrice MOLTO IDROFILA e facile da derivatizzare. Fig.1: Cellulosa: Struttura chimica Fig.2: Trattamento della cellulosa asciutta (a) con NaOH: effetti (b) Agarosio: E un polisaccaride ottenuto dall agar (estratto da alghe). E composto da catene del disaccarise AGAROBIOSO (D-GALATTOSO e 3,6-ANIDRO-1 GALATTOSO). [figura 3] Struttura: gel IDROFILO MOLTO POROSO ottenuto per raffreddamento di soluzioni 2% w/v. [figura 4]. Fig.3: Agarosio: Struttura chimica Fig.4: Struttura del gel

8 Dettaglio matrici Destrano E un POLISACCARIDE EXTRACELLULARE prodotto dal batterio Leuconostoc mesenteroides. E formato da catene di GLUCOSIO con legame α 1-6. E meno stabile della cellulosa all idrolisi acida ma regge il trattamento con 0.1 M di HCl fino a 2 ore. Stabile a ph Cross-linking: EPICLORIDRINA Poliacrilamide Si ottiene per polimerizzazione dell ACRILAMIDE. L agente che permette il cross-linking è la N,N METILEN-BISACRILAMIDE. La matrice che si ottiene è adatta soprattutto alla gel-permeation. E autoclavabile e ha buona stabilità chimica tuttavia il monomero dell acrilamide (tossico) può essere lentamente rilasciato. Unità ripetitiva della poliacrilamide

9 STUDIO DELLE PROTEINE Separazione in base alla dimensione/taglia molecolare: CROMATOGRAFIA DI GEL FILTRAZIONE O ESCLUSIONE MOLECOLARE

10 Cromatografia di gel filtrazione (o esclusione molecolare)

11 Teoria: ripartizione e costante di avanzamento (Kav) Ciascuna molecola presenta in cromatografia di gel filtrazione un comportamento caratteristico dettato dalla sua taglia molecolare e descritto da un coefficiente di distribuzione (Kd) tra fase mobile e fase stazionaria. Kd rappresenta la frazione della fase stazionaria disponibile per la diffusione di una determinata molecola Operativamente tuttavia si preferisce definire una COSTANTE DI AVANZAMENTO Kav che è facilmente determinabile e come Kd descrive il comportamento della molecola durante la separazione

12 Teoria: ripartizione e costante di avanzamento (Kav) Kav = (Ve Vo) / (Vt( Vo) Ve = volume di eluizione Vo = volume vuoto Vt = volume totale Rispetto alla Kd si effettua una semplificazione considerando (Vt-Vo) invece di Vi=Vt-Vo-Vmatrice (volume dei pori dentro la matrice disponibile per la diffusione libera di piccole molecole)

13 Vo Vt-Vo Vt

14 L efficienza di una colonna si valuta in base al numero di piatti teorici per metro: N=5.56x(Ve) 2 / Vh x 100/L dove: Ve: volume di eluizione Vh: volume a ½ altezza del picco L: lunghezza della colonna in cm Separazione 1% acetone

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16 STUDIO DELLE PROTEINE Separazione in base alla carica superficiale: CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO (scambio cationico per proteine basiche o anionico per proteine acide)

17 Cromatografia di scambio ionico (IEXC) Sito carico sulla matrice della resina Proteina o molecola carica da separare Ione del sale che compete con il legame La Ion EXchange Chromatography: separa in base a differenze di carica superficiale

18 Schema IEXC (scambio anionico) A: colonna equilibrata con bassa concentrazione di NaCl B: le macromolecole cariche interagiscono con la matrice spostando i controioni associati (Cl - ) C: aumentando la concentrazione di sali le macro-molecole meno acide vengono eluite D: ad elevata concentrazioni di sali vengono eluite anche le molecole molto acide

19 SCAMBIO ANIONICO MATRICI FUNZIONALIZZATE SCAMBIO CATIONICO

20 Per le proteine i gruppi principali coinvolti sono: + Lys (pka= 10.5), Arg (pka= 12.5), His (pka= 6), N-terminale (pka= 9-11) - Glu, Asp (pka= 2-5), Cys (pka= 8.3), Tyr (pka= 10) pi: ph al quale la carica netta della proteina è nulla ph < pi< ph + - Visto il tipo di interazione è necessario che la proteina sia carica e quindi la separazione si effettua ad un ph che sia almeno 1 unità maggiore o minore del pi. NB: interessa la carica SUPERFICIALE e LOCALE anche se ph=pi La cromatografia a scambio ionico prende il nome di: SCAMBIO ANIONICO - SCAMBIO CATIONICO + in base alla carica del CONTROIONE che può associarsi e dissociarsi dalla fase stazionaria carica.

21 Effetto del ph + Carica proteina - ph acido ph basico

22 Eluizione Dopo l applicazione del campione le colonne (ad eccezione dei quelle per gel-filtrazione) vengono solitamente lavate con un volume dello stesso tampone utilizzato per equilibrarle; questo per rimuovere i contaminanti non legati. L eluizione può essere: ISOCRATICA: la composizione dell eluente non cambia CON GRADIENTE A SCALINI: la composizione viene cambiata in modo discontinuo almeno una volta, per eluire selettivamente. Conc. eluente Conc. eluente tempo tempo CON GRADIENTE CONTINUO: il gradiente varia in modo continuo, incrementando gradualmente le condizioni favorevoli alla dissociazione delle molecole di interesse dalla colonna Conc. eluente tempo

23 Esempi di effetto del gradiente Pendenza del gradiente: Un gradiente RIPIDO ( STEEP ) permette di ottenere picchi più stretti (la coda del picco è eluita ad una velocità leggermente maggiore del fronte perché sottoposta all effetto di una maggiore concentrazione dell eluente). Tuttavia la risoluzione può essere diminuita perché la selettività (= distanza tra i picchi) è minore. Diminuendo la pendenza del gradiente ( SHALLOW gradient) di ha un maggior effetto di allargamento delle bande e i picchi sono più larghi e spesso scodati ma si possono risolvere meglio. In alcuni casi, se si ha a disposizione un formatore di gradiente automatico, si possono programmare in modo alternato segmenti di gradiente lineare a diversa pendenza.

24 STUDIO DELLE PROTEINE Separazione in base alla idrofobicità superficiale: CROMATOGRAFIA DI INTERAZIONE IDROFOBICA

25 Cromatografia di interazione idrofobica (HIC): teoria Si basa sull interazione idrofobica tra la superficie della resina (che porta gruppi octile o fenile) e quella della proteina (o macromolecola) da separare. La proteina possiede sulla superficie un film di molecole d acqua in struttura ordinata in corrispondenza delle regioni idrofobiche. L interazione di queste regioni con altre della stessa natura è favorita da un S > 0: la rimozione di queste molecole d acqua ordinate aumenta l entropia del sistema. Il G = H -T S risulta negativo e la reazione è perciò spontanea ( H è piccolo).

26 STUDIO DELLE PROTEINE Separazione in base a caratteristiche di funzione: CROMATOGRAFIA DI AFFINITA

27 Cromatografia di affinità: Utilizzata per purificare biomolecole che si assorbono in modo SPECIFICO e REVERSIBILE ad un ligando immobilizzato sulla matrice.

28 P+L PL K L = [P] [L] [PL] [L] = [PL] K L [P] Se [PL]=95 [P] 5 1: condizione ideale, il ligando e la biomolecola non vengono alterati 2: si promuove un cambiamento di conformazione di P e L 3: competizione con molecola simile a P, L rimane bloccato 4: competizione con molecola simile a L, P rimane bloccato allora K L deve essere 1/100 della [L] (es. [L] = 1mM allora K L deve essere 10 5 M Range utile: K L = M

29 Cromatografia di affinità: tabella ligandi utilizzati

30 Riconoscimento di TAG e FLAG in proteine ricombinanti Le proteine ricombinanti vengono spesso espresse come proteine di fusione in vettori specifici. Il vettore possiede un sito di inserzione della sequenza codificante in FRAME con la traduzione sequenza che codifica per una proteina o un frammento di proteina all N o al C terminale della proteina da purificare. Questo TAG o FLAG è una etichetta o bandierina di riconoscimento che può essere selettivamente legata ad anticorpi, ligandi o recettori specifici per cromatografia di affinità. Il frammento FLAG viene poi rimosso per azione di una proteasi specifica, il cui sito di riconoscimento viene anch esso progettato sul vettore in modo da risultare nella posizione adatta ad ottenere la proteina di interesse nella forma integra e nativa.

31 Resina coniugata all avidina per proteine ricombinanti Biotin-TAG

32 Maltose-binding-protein

33 Proteine di fusione con Glutatione-S-transferasi (GST)-TAG

34 : CATECOLO 1,2 DIOSSIGENASI OH Cat1,2DO OH OH COOH OH O 2 OH OH COOH Catecolo Acido cis-cis muconico

35 Proteine di fusione con Glutatione-S-transferasi (GST)-TAG: FASE 1: caricamento del campione FASE 2: lavaggio per rimuovere i contaminanti proteine contaminanti di E.coli

36 FASE 3: eluizione specifica della proteina di fusione con glutatione libero PRINCIPIO: Il glutatione libero in eccesso compete con il glutatione coniugato alla matrice e pertanto spiazza la proteina legata che si ritrova nella fase mobile e viene raccolta nell eluato

37 Cromatogramma Numero frazioni ASSORBANZA 280 nm Abs 280 nm 3 2,9 2,8 2,7 2,6 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, frazione

38 STUDIO DELLE PROTEINE Purificazione delle proteine 2. Determinazione quantitativa della concentrazione

39 METODI Determinazione della concentrazione di proteine totali Indiretti Metodo di Kjeldahl (determinazione dell azoto totale) Diretti Spettrofotometria UV (280 nm e lontano UV) Metodo del Biureto Metodo di Lowry Metodo di Markwell (o Lowry modificato) Metodo di Bradford (o del legame con coloranti) Metodo dell acido bicinconinico (BCA) Metodo Silver-binding

40 I Metodi spettrofotometrici Premessa: tutti i metodi diretti di dosaggio delle proteine si basano sulla rilevazione spettrofotometrica e quindi sull analisi quantitativa dello spettro UV/visibile. I 0 x x I I= x I K -di=i K dx -di/i=kdx I di/i =-K x dx I0 0 ln I 0 /I =Kx I 0 = intensità luce incidente I = intensità luce trasmessa Trasmittanza: T = I/I 0 (I 0 =100) Assorbanza. A = = log 1/T A=Log I 0 /I T varia tra A varia tra 0- (max. 2-4) Legge di Lambert-Beer Se ln (I 0 /I) A risulta che A=Log I 0 /I = Kx/2.303= K x con K = ε c A=ε c x ε = A/cx in M -1 cm -1

41 Spettrofotometria UV La maggior parte delle proteine presenta un massimo di assorbimento a 280 nm, dovuto al gruppo fenolico della tirosina e al gruppo indolico del triptofano. Il coefficiente di estinzione molare ε può essere espresso come ε 280 1% o ε mg/ml e varia in modo significativo da proteina a proteina, a seconda della composizione aminoacidica e della struttura. Il range è con estremi a 0 (parvalbumina e proteine leganti il calcio correlate) e 2,65 (lisozima). Il metodo è quindi poco accurato e viene utilizzato solo quando l ε è noto e la calibrazione è stata effettuata contro uno standard della stessa proteine, possibilmente pesata (peso secco). La sensibilità è relativamente bassa e richiede mg di proteina/ml. Inoltre è sensibile alle interferenze di altri composti che assorbono nella stessa regione dello spettro UV, in particolare acidi nucleici (260 nm). In questo caso si può applicare la formula di correzione: PROTEINA (mg/ml) = 1.55 A A 260 Si utilizzano cuvette in quarzo Il metodo è rapido e NON DISTRUTTIVO

42 Metodo di Bradford Questo metodo si basa sull interazione con il colorante Coomassie Brilliant Blue G250. Il legame con le proteine causa uno shift della assorbanza massima da 465 a 595 nm. Molto sensibile: mg prot./ ml (5-100 µg /ml microassay) E molto dipendente dalla composizione in aminoacidi: SI LEGA AGLI AMINOACIDI BASICI (soprattutto arginina) e AROMATICI (interazioni idrofobiche).

43 Assorbanza 595 nm 2 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Concentrazione (µg/ml)

44 Volume totale (ml) Concentrazion e proteine (mg/ml) Protein e totali (mg) Attività per 50 µl di campione ( Abs/min) Attivit à totale ( Abs/ min) Attività specifica ( Abs/min/ mg proteina) Attività specifica ( conc M /min/mg proteina) Fattore di purifica zione Resa % EG C1,2DO

45 STUDIO DELLE PROTEINE Purificazione delle proteine 3. Elettroforesi: elettroforesi su gel di poliacrilamide SDS-PAGE

46 Elettroforesi In generale, si tratta di un processo mediante cui molecole cariche si separano, in presenza di un campo elettrico, in base alla loro diversa mobilità. La mobilità o velocità di migrazione v dipende da: E: intensità del campo elettrico z: carica netta superficiale della particella f: coefficiente di forza contraria alla migrazione La relazione è la seguente: v = anche se si preferisce definire non le velocità di migrazione assoluta (v = distanza / tempo) ma la mobilità relativa (Rf = distanza percorsa dalla particella d interesse / distanza percorsa da un colorante - traccia anionico ad elevato rapporto carica:massa): Rf = E f f z E z

47 Mobilità elettroforetica viene definita come: µ = v/e = z/f NB: Il coefficiente frizionale f dipende dalle dimensioni, dalla forma e dallo stato di solvatazione della molecola carica che migra nel campo elettrico IN PRATICA LA MOBILITA DIPENDE DAL RAPPORTO CARICA/MASSA

48 Elettroforesi su gel poliacrilammide (PAGE e SDS-PAGE) OSO 3 Na + sodio dodecil solfato Proteina L SDS conferisce un eccesso di carica negativa alla proteina e ne promuove lo srotolamento

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50 ph=8.2 SDS-PAGE: sistema discontinuo ph=6.8 Acrilamide 4% ph=8.8 Acrilamide 12% In questo sistema il campione caricato nel pozzetto viene concentrato all interfaccia tra stacking e running gel e la separazione effettiva avviene nel running gel con migliore risoluzione

51 STUDIO DELLE PROTEINE Purificazione delle proteine 4. determinazione della massa tramite SDS-PAGE tramite cromatografia di esclusione molecolare

52 In SDS-PAGE esiste una relazione lineare tra Rf e log MW Rf= Distanza migrazione del campione Distanza migrazione del fronte Lf: Distanza migrazione del fronte (colorante) Lc: Distanza migrazione del campione (proteina) kda Lc Lf

53 CROMATOGRAFIA DI GEL FILTRAZIONE: Esiste una relazione lineare tra la Kav e il logaritmo della taglia molecolare

54 Separazione di campioni proteici a massa molecolare nota

55 Log MW (variabile x) Kav (variabile y) Kav = f(log MW) 0<Kav<1 Log MW di campioni standard noti Kav determi nata per campioni standard noti Per un campione di MW ignota si misura la Kav e si risale al MW