METODI IN PROTEOMICA DIFFERENZIALE

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1 METODI IN PROTEOMICA DIFFERENZIALE

2 PRINCIPIO COMUNE: ANALISI SIMULTANEA DEI CAMPIONI DA CONFRONTARE Proteine di diversa provenienza sono modificate in maniera differenziale. Le alterazioni prodotte differenzialmente sulle proteine o non interferiscono con la loro analisi o interferiscono in maniera analoga. Le caratteristiche delle modificazioni sono tali da poter essere rintracciate.

3 DIGE: 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis Campione di controllo,, campione trattato e standard interno vengono colorati con sonde fluorescenti diverse ( (CyDye; Amersham Bioscences) prima della prima dimensione,, ed applicati sullo stesso gel 2-D. 2 Molti problemi legati alla variabilità dei gel sono eliminati! Sensibilità elevata e compatibilità con tecniche di spettrometria di massa rendono questa metodica ottimale per gli studi di proteomica differenziale.

4 λ ex 488nm λ em 520 BP40 Filters FLUOROFORI USATI: λ ex 532nm λ em 580 BP30 Filters Cy2, Cy3, Cy5 Massa (circa 500) e Carica (+) dei fluorofori sono uguali Gli spettri (eccitazione ed emissione) sono DIVERSI MULTICOLOR DETECTION Linearità di risposta fino a 4 ordini di grandezza Sensibilità elevata ( 125 pg di transferrina) λ ex 633nm λ em 670 BP30 Filters Possibili gruppi reattivi: N-idrossisuccinimidil estere (NHS estere) Maleimide LYS CYS

5 I fluorofori usati per la tecnica DIGE si legano ai gruppi ε-nh 2 di residui di lisina delle proteine presenti nel campione. Nelle condizioni sperimentali usate ( (minimal labelling reaction), mediamente si lega una molecola di colorante per proteina (1-2% dei residui di Lys). Non si hanno variazioni apprezzabili nén peso molecolare nén di punto isoelettrico. di protein protein

6 PREPARATIVE GEL LABELING Il gruppo reattivo reagisce con le cisteine. Si lavora in condizioni di maximal labeling (alto rapporto fluoroforo/proteine). Si cerca di ottenere la derivatizzazione di tutte le cisteine disponibili (saturation labeling).

7 Le proteine vengono modificate prima di effettuare la corsa elettroforetica!!! Lo standard interno viene preparato derivatizzando con uno dei fluorofori una miscela 1/1 dei due campioni in analisi ( controllo e trattato/patologico ).

8 ESEMPIO DI APPLICAZIONE: determinazione rapida di marker proteici associati a stati patologici

9 TIPICA PROCEDURA PER ANALISI DIGE I GEL ottenuti seguendo la procedure DIGE possono anche essere sottoposti a colorazioni successive (es. Deep Purple Total Protein Stain)

10 Vantaggi della tecnica DIGE: L uso di standard interno elimina problemi dovuti alla variazione del sistema. Le misure delle variazioni di espressione delle proteine meno abbondanti sono più accurate. Minori problemi relativi al rumore di fondo (lo stesso per entrambi i campioni da comparare); le differenze osservate sono relative solo alle variazioni biologiche e non a variazioni tecniche. Con il sistema DIGE è possibile rilevare e quantificare differenze fra i campioni inferiori al 10%.

11 Problemi della tecnica DIGE: Condizioni di labeling critiche. È richiesto l uso l di un software dedicato. Per la normalizzazione è sempre richiesto un terzo campione (standard interno). Si possono verificare piccoli incrementi di peso molecolare delle proteine (cambio di posizione sul gel legato vs non legato). Dal momento che i reattivi si legano solo a residui di lisina o cisteina,, alcune proteine possono essere non rivelate (~13% ). Costi elevati.

12 LIMITI DELLO STUDIO PROTEOMICO CLASSICO In ogni cellula c è un enorme e dinamico divario di espressione e di tipologia (es. PM, pi, idrofobicità, compartimentazione ) fra le varie proteine; il metodo ideale di analisi dovrebbe essere in grado di IDENTIFCARLE e QUANTIFICARLE tutte!

13 2-D D PAGE:... non necessariamente è la migliore tecnica per l analisi proteomica Svantaggi della 2-D PAGE: Limitata all analisi di proteine con 10 4 Da < P.M. > 10 6 Da. Non adatta alla separazione di proteine idrofobiche (es. di membrana). Scarsa risoluzione per proteine con 4 > pi > 10. Non si rilevano proteine espresse a bassi livelli. Buona separazione solo per un max di spots. Scarsa riproducibilità fra gel. Quantificazione difettosa (dipende dal sistema di rivelazione). L analisi non è accoppiata direttamente alla separazione.

14 CROMATOGRAFIA MULTIDIMENSIONALE Nella cromatografia multidimensionale (MudPIT, multidimensional protein identification technology) due (o più) tecniche con proprietà ortogonali vengono combinate in modo da incrementare il potere di separazione. Nano-HPLC PRIMA DIMENSIONE: es. Esclusione molecolare, Scambio ionico, elettroforesi capillare,. SECONDA DIMENSIONE: es. Fase inversa, Scambio ionico, Esclusione molecolare, SPETTROMETRIA DI MASSA: Ionizzazione: : ESI Analisi: triplo quadrupolo, trappola ionica, analizzatori ibridi (Q-TOF) TOF).. Si analizzano direttamente i peptidi prodotti per proteolisi specifica! GENES 35,000 PROTEINS 200,000 TRYPTIC PEPTIDES 4,000,000

15 2D - LC/LC La miscela peptidica ottenuta per digestione specifica delle proteine contenute in un campione*, viene separata mediante 2D-LC bidimensionale, prima dell analisi MS/MS. * Può anche essere un campione ottenuto dopo 2D-E/ digestione in gel (trypsin) I peptidi vengono fatti legare ad una colonna a SCAMBIO CATIONICO; la successiva eluizione con un gradiente salino, separa i peptidi in funzione della loro carica I peptidi vengono quindi separati in funzione della loro idrofobicità su una colonna a FASE INVERSA

16 Stable isotope labeling methods - Isotope-Coded Affinity Tagging (ICAT) -Hydrogen vs deuterium (8 Da separation) - 13 C vs 12 C (9 Da separation) - Isotope Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation (itraq) - Four isobaric reagents - Compare quantity of reporter molecule in MS/MS -Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC) -Cell growth in stable isotope-enriched media ( 13 C Glucose, 15 N Ammonium, 2 H Water)

17 Esempio di un reagente ICAT Biotin Affinity tag: Permette il legame selettivo ad una resina di streptavidinaagarosio Gruppo reattivo: La reattività verso gruppi tiolici permette il legame con residui di cisteina NH O S NH O H N Linker: la versione pesante ha atomi di deuterio nei punti contrassegnati con *; negli stessi punti, la versione leggera ha atomi di idrogeno * * O O O * * H N O I

18 I campioni proteici da confrontare, dopo ESTRAZIONE, vengono TRATTATI col reagente pesante o con quello leggero. I due campioni vengono MISCELATI, DIGERITI, ISOLATI ed ANALIZZATI. Gruppo reattivo: forma un legame covalente con residui di Cys di proteine o peptidi Isotope-labeled linker ( pesante o leggero ) Affinity tag: permette di isolare proteine o peptidi legati all ICAT mediante cromatografia di affinità in un unico step

19 Campione A Campione B Derivatizzato con reagenti ICAT leggeri (L) Derivatizzato con reagenti ICAT pesanti (H) Digestione con enzimi proteolitici Digestione con enzimi proteolitici Unione dei digeriti Purificazione mediante affinità dei peptidi recanti il gruppo derivatizzante Analisi LC/MS (nano HPLC - MuDPIT) MS Comparazione abbondanze peptidi (L & H) => dati quantitativi sui livelli d espressione MS/MS identificazione

20 Quantification MS Identification MS/MS 100 Light NH 2 -EACDPLR-COOH 100 Heavy m/z m/z

21 Vantaggi vs Svantaggi Quantifica i livelli di proteina fra campioni diversi, con un elevato grado di accuratezza Può essere usato con miscele complesse di proteine Il legame Cys-specifico riduce la complessità del campione I peptidi possono essere sequenziati direttamente con tecniche MS-MS Costoso Frammentazione del Tag Assenza di residui di cisteine o non accessibilità al reagente (solo ~8% dei peptidi contiene Cys) Limitate interferenze nella corsa cromatografica

22 Isotope Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation (itraq) - Si possono marcare differenzialmente ed analizzare fino a 4 campioni. - Le proteine vengono digerite prima della marcatura. - Il marcatorereagiscecon i gruppin-terminali. - La composizione aminoacidica non influenza la possibilità di analisi TUTTI I PEPTIDI VENGONO ANALIZZATI -Gli ioni dei peptidi modificati possono essere selezionati per esperimenti MS/MS. Il gruppo reporter viene perso durante la frammentazione. - L abbondanza ionica relativa dei peptidi può essere valutata direttamente dall abbondanza ionica relativa dei 4 gruppi reporter.

23 itraq Ross, P. L. et al. (2004) Mol Cell Proteomics 3(12):

24 itraq - Peptides have the same mass from each of the samples - MS/MS of selected mass yields - Fragmentation spectra for the identification of peptide - Reporter group gives relative abundance information

25 itraq Sample 1 Sample 2 Reduce & Alkylate Trypsin digest Label w/ 114 tag Label w/ 115 tag Mix, dilute in SCX buffer Sample 3 Label w/ 116 tag SCX Capillary RPLC-MS Sample 4 Label w/ 117 tag Ross, P. L. et al. (2004) Mol Cell Proteomics 3(12):

26 Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC) - Cells grown in media enriched with stable isotope-containing amino acids - Only works in cells that require addition of essential amino acids - Quantification limited to proteins/peptides that contain labeled amino acid Unlabeled cells Labeled cells Combined cells Protein purification Trypsin digestion Mass spec identification/quantification

27 NB: campione deve essere normalizzato in partenza => stesso numero di cellule dallo stato A e dallo stato B Dalle abbondanze relative dei peptidi derivati dalla/e stessa/e proteina/e, si può risalire a variazioni nei livelli d espressione di più proteine

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