Proteomica: Gel bidimensionale e Sistemi di Spettrometria di Massa

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1 Proteomica: Gel bidimensionale e Sistemi di Spettrometria di Massa DNA RNA Mantenimento e trasmissione informazione L informazione di base di un organismo è uguale per tutte le sue cellule GENOMICA Trasferimento informazione L utilizzo dell informazione è differenziale a seconda del tipo di cellula e del particolare contesto biologico preso in considerazione PROTEINE PROTEOMICA Effettori molecolari Il complemento proteico è differente a seconda del tipo di cellula e del particolare contesto biologico preso in considerazione 1

2 Gestione dell immagine (scanner,etc) Colorazioni proteiche in gel (Coomassie, argentiche, Derivatizzazioni Chimiche Fluorofori differenziali (2D) (scanner con lapossibilità di illuminare i gel a determinate lunghezze d onda) 2D gel dalla tecnologia dei DNA array Protein array (nanotecnologie) Metodologie di studio per le interazioni proteina-proteina Proteomica Spettrometria di massa MS Protein sequencing Derivatizzazioni Chimiche ICAT (MS) -shotgun proteomics Cromatografia RP-HPLC / Multi dimensional chromatography (Miniaturalizzazione colonne) Preparazione del campione sviluppo di detergenti, agenti riducenti, etc Robotica (Dalla preparazione del campione all interpretazione dei dati) Bioinformatica Banche dati Swiss-prot. etc Peptide fingerprinting Sequenziamento genomi DNA RNA Proteine La cellula GENOMA Funzionamento del macchinario cellulare (enzimi, proteine strutturali) PROTEOMA 2

3 A che cosa serve la proteomica? Sicuramente a complicarci la vita!!!! Quali sono le domande alle quali la Proteomica può dare una risposta Quali proteine sono espresse in un determinato tipo cellulare/tessuto/organo/organismo Quali proteine sono differenzialmente espresse oppure modificate (sia in termini qualitativi che quantitativi) confrontando due (o più) fenotipi cellulari Un esempio di diversi fenotipi cellulari potrebbe essere: Cellule di origine diversa; Cellule dello stesso tipo sottoposte a stimoli diversi; Cellule dello stesso tipo soggette o meno a condizioni patologiche. IDENTIFICARE PROTEINE CARATTERISTICHE di UNA DETERMINATA CONDIZIONE CELLULARE MARKERS? FUNZIONE 3

4 Quali sono le domande alle quali la Proteomica può dare una risposta Quali proteine sono differenzialmete soggette ad una particolare PTM confrontando fentotipi cellulari diversi: studio delle modifiche posttraduzionali Fosfoproteoma Metilproteoma Acetilproteoma Ubiquitinproteoma Stabilire l insieme di tutte le proteine soggette alla medesima modificazione post-traduzionale e seguirne i cambiamenti in risposta a determinate condizione Identificare pathway specificamente attivate in seguito ad uno stimolo tramite l identificazione dei substrati Risponde a domande cui non può rispondere lo studio del materiale genetico: perché ci sono modifiche che avvengono dopo la trascrizione e la traduzione e che sono importanti per la determinazione delle funzioni cellulari. Post-Translational Maturation of Ras GDP S C GDP S C-(Me) a 1 a 2 X GDP S Ca 1 a 2 X GDP SH CaaX 4

5 HMG Co-A Mevalonato Statine Colesterolo FPP Sintasi Farnesil-PP Farnesil-transferasi Geranil-Geranil-PP Geranil-geranil transferasi Membrana Plasmatica RAS RAS 2D gel electrophoresis and Western Blotting for ras M. Caraglia et al., unpublished results 5

6 Quali sono le domande alle quali la Proteomica può dare una risposta Quali proteine costituiscono/sono presenti in un determinato complesso macromolecolare/organello IDENTIFICAZIONE RUOLO NEL COMPLESSO/ORGANELLO MODULAZIONE ATTIVITA COMPLESSO/ORGANELLO ATTRAVERSO PROTEINA Quali sono le domande alle quali la Proteomica può dare una risposta Quali proteine interagiscono con una determinata proteina (X) Determinazione del network molecolare di una proteina (X) IDENTIFICAZIONE FUNZIONE DELL INTERAZIONE MODULAZIONE ATTIVITA DELLA PROTEINA (X) 6

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8 Approccio proteomico Prefrazionemento Preparazione del Campione Separazione delle proteine Rilevazione delle proteine Identificazione ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE Cerca una variazione di A) espressione o di B) modifica strutturale posttrascrizionale di una proteina, ma non necessariamente da sola è in grado di identificare quale proteina è e/o quale modifica post-trascrizionale è. 8

9 Preparazione del Campione Requisiti: => Riflettere la composizione proteica della cellula/tessuto in indagine => Evitare contaminazioni => Evitare modificazioni Agenti caotropici: UREA-TIOUREA permettono alle proteine di destrutturarsi mostrando il loro core idrofobico, quindi servono a mantenere in soluzione le proteine idrofobiche Agenti surfattanti: CHAPS per solubilizzare i residui idrofobici.. Agenti riducenti non carichi (no DTT) Tributilfosfina (TBP) Necessari per rompere i ponti disolfuro S-S e mantenere in forma ridotta le proteina. Non carico: la solubilità proteinca aumenta di molto e si migliora il trasferimento. Iodoacetamide Ridurre ed alchilare la proteina prima della IEF. Rimozione degli acidi nucleici: ANFOLITI CARRIER: piccole molecole organiche polimeriche, altamente solubili, formano complessi con gli acidi nucleici che vengono rimossi dopo ultracentrifugazione. Sono molecole che vengono utilizzate per creare gradienti di ph. A seconda dell intervallo di ph scelto per l analisi di isolettrofocusing vengono selezionate miscele di anfoliti su misura (IPG buffer - immobilzed ph gradient buffer). Rimozione degli acidi nucleici: Sali precipitazione Lipidi etanolo/acetone Proteasi ph ISOELETTROFOCALIZZAZIONE PRIMA DIMENSIONE SESSSKSSQP LASKQEKDGT EKRGRGRPRK QPPVSPGTAL VGSQKEPSEV PTPKRPRGRP Number of amino acids: 106 Molecular weight: KGSKNKGAAK TRKTTTTPGR KPRGRPKKLE KEEEEGISQE SSEEEQ 1 Nterm + 11 R + 1 D + 14 E + 16 K + 1 Cterm Theoretical pi: Amino acid composition: Ala (A) 4 3.8% Arg (R) % Asn (N) 1 0.9% Asp (D) 1 0.9% Cys (C) 0 0.0% Gln (Q) 6 5.7% Glu (E) % Gly (G) % His (H) 0 0.0% Ile (I) 1 0.9% Leu (L) 3 2.8% Lys (K) % Met (M) 0 0.0% Phe (F) 0 0.0% Pro (P) % Ser (S) % Thr (T) 8 7.5% Trp (W) 0 0.0% Tyr (Y) 0 0.0% Val (V) 3 2.8% algoritmo pi: ph al quale la carica netta della proteina = 0 Se sottoposta all azione di un campo elettrico non si muove Focalizzazione - CONCENTRAZIONE 9

10 ddp pi = pi = ph3 + + ph = ph = ph10 Una proteina dispersa in un gradiente di ph, si troverà ad avere carica netta positiva, negativa oppure nulla (se si trova gia ad un ph pari al suo pi). Sottoposta all azione di un campo elettrico opportunamente orientato essa si muoverà, a seconda della carica che reca verso l elettrodo di segno opposto, fino a raggiungere il ph pari al suo pi. In questo punto essa assume carica netta nulla e non è più sottoposta all azione del campo elettrico. Se per una qualsiasi ragione essa si muove a dx o a sx, allontanandosi dalla regione dove ph=pi, essa assume una carica e viene nuovamente focalizzata. => Questo conferisce l alta risoluzione che si ha nelle analisi di isoelettrofocalizzazione. E doveroso ricordare che più distante una proteina si trova dal suo pi (in termini di ph) maggiore sarà la sua carica e dunque anche la sua mobilità elettroforetica, mano a mano che essa si avvicina al ph pari al suo pi, la sua carica netta diminuisce e di conseguenza diminuisce anche la sua mobilità elettroforetica => il processo di focalizzazione è un processo che solitamente richiede tempi lunghi, proprio per questo fatto! Gradienti di ph immobilizzati: reidratazione I gel recanti i gradienti di ph immobilizzati sono di solito deidratati e devono essere reidratati in opportune condizioni: Si reidratano in modo da poter condurre in seguito la corsa elettroforetica: Il metodo più comunemente usato prevede che i gel vengano messi a contatto con un volume specifico (a seconda delle loro dimensioni) di una soluzione di reidratazione: 8 M Urea (o in alternativa la composizione usata per il lysis buffer), 4-0,5 % CHAPS, 0,2 % DTT (o altri agenti riducenti), 0,5% (fino a 2% nel caso di strip da 24 cm) IPG buffer, 10% glicerolo e 0,002% BBF. Fenomeno dell elettroendosmosi: Nel caso ci siano cariche fisse (in particolare cariche negative (-) sulla matrice che forma il gel queste non possono migrare in un campo elettrico ma hanno solitamente dei controioni (possono essere dei cationi con la loro sfera d idratazione o stessi H 3 O + ) che migrano verso il catodo creando un vero e proprio flusso di acqua. (fenomeno che portava a dei problemi notevoli utilizzando gradienti di ph non immobilizzati => distorsione/spostamento del gradiente di ph). Il glicerolo aumentando la densità del mezzo diminuisce/minimizza questo effetto - importante anche durante il trasferimento delle proteine dalla prima alla seconda dimensione. Tale fenomeno si sfrutta in modo positivo nell elettroforesi capillare (elettroforesi condotta in assenza di una matrice solida reticolante, ovvero in soluzione libera), dove crea un vero e proprio flusso in grado di trasportare anche molecole con carica opposta verso il catodo). anodo + ph3 Flusso di acqua catodo ph10-10

11 Seconda dimensione: SDS PAGE Separazione elettroforetica che discrimina le varie proteine in base al loro PESO MOLECOLARE Sodio dodecilsolfato (SDS) L SDS si lega alle proteine mediante la sua porzione idrofobica e rompe sia le strutture secondaria che terziaria (non i legami disolfuro). Ogni molecola di SDS possiede una carica negativa e su ogni mg di proteina si legano circa 1,4 mg di SDS [equivale a dire che c è una molecola di SDS circa ogni 2 aa]. L elevata carica negativa (la forza di repulsione che le cariche negative esercitano fra di loro) conferita alla catena polipetidica la rende praticamente lineare. L elevata carica negativa conferita dall SDS rende trascurabile la carica propria della proteina. Dato che l SDS si lega con la stessa stechiometria a tutte le proteine il rapporto massa/carica è uguale per tutte le proteine. Questo fa si che sia esclusivamente l ingombro sterico ad influenzare la migrazione (mobilità elettroforetica) in una matrice a porosità controllata (gel di poliacrilammide) con applicata una differenza di potenziale. Orientamento canonico della seconda dimensione ph minore ph maggiore ph minore ph maggiore PM minore PM minore PM minore PM minore Supporto plastica 1 a dimensione Supporto plastica 2 a dimensione Supporto plastica 2 a dimensione Supporto plastica 1 a dimensione 11

12 Metodi per la rilevazione di spot proteici Requisiti ideali per un metodo di rilevazione di spot proteici da 2D Alta sensibilità Permettere analisi quantitative Compatibile con MS Rapido Economico Non tossico 12

13 2D-DiGE (2-D fluorescence difference gel electrophoresis) La colorazione (labelling) avviene prima della corsa elettroforetica Campioni proteici marcati in modo differenziale possono essere separati sul medesimo gel bidimensionale - minimizzare veariazioni gel-gel- Impostando le opportune lunghezze d onda d eccitazione e di emissione è possibile visualizzare le proteine derivanti dal campione 1, quelle dal campione 2 oppure ottenere un immagine relativa alla sovrapposizione dei due campioni Derivatizzazione delle proteine con molecole fluorescenti (aventi differenti ecc. & emiss.) Separazione proteine tramite 2D gels Visualizzazione mediante speciali scanner 13

14 IDENTIFICAZIONE DEGLI SPOTS Segue necessariamente alla elettroforesi bidimensionale ed ha lo scopo di identificare le proteine e le loro modifiche post-trascrizionali!!!! Si esegue un vero e proprio identikit molecolare SPOT PICKER Queste strumentazioni possono operare anche modo semi-automatico - controllo visivo dell operatore sugli spots prelevati - Sistemi di lavaggio evitano cross-contaminazioni 14

15 Digestione enzimatica MS SPOT PEPTIDI Peso Molecolare dei singoli peptidi PEP 1 PRO Insieme di pesi molecolari PEP 2 PEP Insieme PEP caratteristico di una PEP determinata... proteina PROTEINA: caratterizzata da una sua particolare e unica sequenza aa PEPTIDE: caratterizzato da una sua particolare e unica sequenza aa PEPTIDE: sequenza aa specifica => peso molecolare specifico Assorbimento su Reversed Phase (C18) di peptidi generati da in gel digestion ZipTip: puntali per pipette eppendorf alla cui punta è impaccata una resina che supporta una fase inversa (tipo C18) sulla quale, dopo che i peptidi eluiti dall in-gel digestion (sciolti in ambiente acquoso), gli stessi peptidi si legano. E possibile, con i peptidi legati alla resina, effettuare una serie di lavaggi in modo da eliminare eventuali contaminanti ed eluire successivamente i peptidi. (Si adottano le stesse strategie di eluizioni che si adottano in cromatografia HPLCafaseinversa.Questa procedura viene utilizzata soprattutto quando si hanno piccoli volumi e si vuole eliminare la presenza di sali. 15

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17 ESI Electrospray ionization Una soluzione con l analita viene nebulizzato tramite un capillare a pressione atmosferica in un forte campo elettrico. Il solvente residuo viene evaporato e l analita ionizzato viene introdotto nell analizzatore di massa ad alto vuoto. ANALIZZATORI: QUADRUPOLO, IONTRAP TOF MALDI matrix assisted laser desorption ionization Il raggio laser viene sparato su una miscela di matrice/analita cristallizzata su una superficie di metallo. La matrice ha la funzione di assorbire l energia del laser e trasmetterla in modo attenuato alle molecole da analizzare. La formazione degli ioni di analita avviene con l adesione dei cationi come H + o Na +. (UV o IR) ANALIZZATORI: TOF 17

18 TOF Time Of Flight FT-ICR Fourier Transfor Ion ciclotron resonance Orbitrap ANALIZZATORE Di MASSA Quadrupolo Trappole ioniche Magnetici Discriminare molecole in base al loro Rapporto massa/carica m/z (NB: informazioni circa il peso molecolare (m) si possono avere solo ed esclusivamente se si hanno informazioni circa lo stato di carica di quella determinata molecola (z)) Analizzatori a tempo di volo - TOF Tubo di Volo (d) Regione di accelerazione V Detector Nella regione di accelerazione, gli ioni vengono sottoposti ad una forte differenza di potenziale che impartisce ad ognuno degli ioni una propria velocità che dipende dal valore del rapporto massa/carica e quindi il tempo per percorrere la distanza tra sorgente e rilevatore è differente. Misurando il tempo di volo (Tempo che lo ione impiega per percorrere il tubo di volo) e calibrando con ioni di noto valore massa/carica, è possibile risalire al peso molecolare dell analita. 18

19 Generazione degli ioni Ad esempio tramite un impulso laser (MALDI) Tubo di Volo (d) V Accelerazione degli ioni mediante V Tubo di Volo (d) 19

20 Ioni hanno acquisito una propria velocità in dipendenza del loro m/z e si muovono verso il detector Le loro diverse velocità separano progressivamente gli ioni con diverso m/z durante il loro cammino verso il detector 20

21 Le loro diverse velocità separano progressivamente gli ioni con diverso m/z durante il loro cammino verso il detector (m/z) 3 (m/z) 2 (m/z) 1 Gli ioni con m/z diversi raggiungono il detector in tempi diversi (m/z) 3 (m/z) 2 (m/z) 1 Ione (m/z) 1 rilevato 21

22 V d 3 d 2 d 1 Gli ioni prodotti in sorgente non partono tutti dalla medesima posizione => Sono soggetti ad accelerazione differenti => Si muovono con velocità differenti => Pur avendo m/z uguale, raggiungono il detector in tempi diversi => Risoluzione strumentale bassa Gli ioni con m/z uguali raggiungono il detector in tempi leggermente diversi a causa della loro differente accelerazione iniziale dispersione (m/z) 3 (m/z) 2 (m/z) 1 Ione (m/z) 1 rilevato 22

23 Analizzatore TOF con reflectron che funge da specchio ionico Il reflector migliora la risoluzione estendendo il percorso di volo dello ione. Ioni aventi m/z uguali risultano avere velocità differenti. Avendo energie cinetiche differenti penetrano in modo differenziale all interno di un campo elettrico riflettente. All uscita del campo elettrico riflettente tutti gli ioni aventi un determinato valore m/z risultano raggiungere il detector al medesimo istante: focalizzati sul detector. Riflettore elettrostatico dispersione Gli ioni accelerati si muovono con velocità diverse verso il reflectron Riflettore elettrostatico 23

24 Gli ioni accelerati si muovono con velocità diverse verso il reflectron Riflettore elettrostatico Gli ioni accelerati si muovono con velocità diverse verso il reflectron Riflettore elettrostatico 24

25 Gli ioni aventi lo stesso m/z ma diversa energia cinetica penetrano differenzialemte nel riflettore. Quelli con energia cinetica maggiore in maggior misura rispetto a quelli con energia cinetica minore. Riflettore elettrostatico All uscita dal reflectron, le velocità sono le stesse rispetto all entrata, ma lo ione con velocità maggiore si trova dietro a quello con velocità minore. Riflettore elettrostatico 25

26 Riflettore elettrostatico Riflettore elettrostatico 26

27 Riflettore elettrostatico Qualora il ritardo dato dal reflectron è opportunamente tarato, i due ioni, aventi comunque velocità diverse, raggiungono il detector in contemporanea. Riflettore elettrostatico 27

28 Spettrometri di massa: MALDI-TOF e ESI-TOF MALDI-TOF ESI-TOF PEPTIDE MASS FINGERPRINTING Una proteina, digerita da un enzima proteolitico noto - è nota quindi la specificità di taglio - dà origine ad una serie di peptidi e ciascuno di essi è caratterizzato da uno specifico peso molecolare. Anche se peptidi che presentano la stessa composizione aa ma sequenza diversa presentano pesi molecolari uguali è statisticamente poco probabile che da proteine diverse si generino più peptidi che presentano la stessa composizione aa ma diversa sequenza. Questo significa che l insieme dei pesi molecolari dei peptidi generatisi dalla digestione endoproteolitica di una proteina risulta essere in pratica una sola e specifica per quella proteina IMPRONTA DIGITALE IDENTITIFICAZIONE (DATABASE) L identificazione risulterà più certa quanto maggiore è l accuratezza con la quale viene determinato il peso molecolare dei singoli peptidi e quanto maggiore è la copertura della intera sequenza della proteina di partenza (sequence coverage) 28

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30 Spettrometria di Massa Tandem (MS/MS) La spettrometria di Massa tandem permette, senza l ausilio di separazioni cromatografiche, l analisi di miscele di prodotti o di molecole complesse che presentano frammentazioni assai complicate. Il primo analizzatore separa ioni ad alta massa (generati da una sorgente soft) tipici di ogni composto della miscela; detti ioni vengono sequenzialmente introdotti in una cella a collisione con atomi di He (seconda sorgente di ionizzazione), gli ioni ulteriormente frammentati vengono avviati al secondo analizzatore e successivamente al rivelatore. Un applicazione abbastanza frequente della spettrometria di massa tandem è quella che vede l impiego di tre quadrupoli, il secondo dei quali funge da cella di collisione con He. L accoppiamento MS/MS può esser utilizzato come: 1. Selezione del primo analizzatore su massa singola (es: ione molecolare protonato) e scansione del secondo analizzatore su un intervallo m/z prefissato (MS/MS di ioni figli). Serve per discriminare composti chimicamente dissimili madotatidipari peso molecolare. 2. Scansione del primo analizzatore su un intervallo m/z prefissato e selezione del secondo analizzatore su un rapporto m/z prefissato di uno ione figlio (MS/MS di ioni progenitori). Serve per misurare la concentrazione di membri di una classe simile. 30

31 Gli ioni sono sottoposti ad una ddp, subiscono delle oscillazioni stabili permettendo allo ione di fuoriuscire dal quadrupolo, o instabili portando lo ione in collisione con le barre metalliche. Solo gli ioni aventi un preciso rapporto massa/carica usciranno dal quadrupolo stesso. 31

32 Trappola ionica Gli ioni sono intrappolati tra due elettrodi e un elettrodo anello. Variando il potenziale elettrico e la frequenza del campo elettrico si espellono in sequenza gli ioni secondo un valore mass/carica crescente 32

33 PROTEOMICA ALTERNATIVA ICAT (ISOTOPE-CODED AFFINITY TAG) Consente l analisi differenziale quantitativa di due campioni. Le proteine del campione vengono marcate ai residui di cisteina con etichette di iodoacetamide-biotina con diversi isotopi (idrogeno/deuterio, C12/C13). Le proteine vengono miscelate e digerite e i peptidi marcati vengono separati da quelli non marcati tramite cromatografia di affinità seguita da MS con ionizzazione ESI. MudPIT Tecnologia di identificazione multidimensionale delle proteine: utilizza una separazione cromatografica in due stadi di tutti i peptidi derivanti dalle miscele proteiche digerite con successiva analisi MS. SELDI-TOF Consente di rilevare le differenze nel pattern di espressione delle proteine ottenuti mediante MALDI-TOF-MS delle proteine legate a del materiale cromatografico spottato su un target della MALDI. 33