TECNICHE IMMUNOCHIMICHE

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1 TECNICHE IMMUNOCHIMICHE

2 Tutte le tecniche immunochimiche si basano sull impiego di anticorpi Struttura tipica di un immunoglobulina (Ig)

3 Le immunoglobuline si dividono in diverse classi, ciascuna dotata di proprieta strutturali e funzionali caratteristiche

4 La specificita e la sensibilita dei metodi immunochimici sono fortemente influenzate dalla tipologia delle Ig impiegate, ovvero: Anticorpi policlonali: derivati da piu di un clone di linfociti B Anticorpi monoclonali* : derivati da un singolo clone di cellule B *(Impiegati in tecniche che richiedono un elevato grado di specificita )

5 Produzione di anticorpi monoclonali mediante impiego di ibridomi

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7 FENOMENO DELL IMMUNOPRECIPITAZIONE Una proprieta importante di molti anticorpi (Ac) e la loro capacita di precipitare gli antigeni (Ag) in soluzione, a seguito della formazione di un reticolo molecolare insolubile; tale fenomeno e strettamente influenzato dalle concentrazioni di Ac ed Ag, infatti si manifesta all interno di un ristretto intervallo di concentrazioni, noto come ZONA DI EQUIVALENZA

8 La formazione del reticolato puo essere impedita dalla presenza di molecole (apteni), che interferiscono con il legame della molecola anticorpale all Ag

9 TECNICHE DI IMMUNODIFFUSIONE Tali metodiche si basano sulla diffusione degli anticorpi e/o degli antigeni nel gel di agarosio, fino alla formazione di una banda di precipitazione a livello del punto di equivalenza

10 IMMUNODIFFUSIONE SEMPLICE Prova allestita con un singolo antigene ed il corrispondente antisiero

11 IMMUNODIFFUSIONE DOPPIA Prova allestita con una miscela di antigeni ed il corrispondente antisiero

12 SRID:Single Radial ImmunoDiffusion L Ag viene caricato nei pozzetti incisi in un gel contenente una concentrazione fissa di Ac; al punto di equivalenza si forma un anello di precipitazione intorno al pozzetto, il cui diametro e in relazione alla concentrazione di Ag

14 Quadri fondamentali di immunoprecipitazione, ottenuti per immunodiffusione doppia a) reazione di identita : le bande si fondono; b) reazione di non identita : le bande si incrociano; c) reazione di identita parziale: le bande collidono

16 IMMUNOELETTROFORESI Dapprima si separa una miscela di proteine contenente l Ag mediante elettroforesi su gel di agar; si lascia poi diffondere l Ac nel gel da un solco parallelo alla direzione di elettroforesi. Dove gli Ac incontrano gli Ag (all equivalenza) si formano archi di precipitazione

17 ROCKET IMMUNOELETTROFORESI Tecnica di adattamento dell immunoelettroforesi radiale semplice; prevede la migrazione dell Ag dai pozzetti incisi nel gel contenente gli Ac; all equivalenza si formano bande di precipitazione a forma di razzo (rocket), la cui area e proporzionale alla concentrazione degli Ag

18 IMMUNOELETTROFORESI BIDIMENSIONALE Le proteine vengono prima separate mediante elettroforesi su gel di agar, poi sottoposte ad elettroforesi in un gel contenente l Ac in direzione perpendicolare a quella della prima elettroforesi

19 MARCATURA DEGLI ANTICORPI Sebbene le tecniche di immunoprecipitazione in agar diano un precipitato visibile del complesso Ag-Ac, nella maggior parte dei dosaggi immunochimici tale reazione puo essere visualizzata solo marcando l Ac (a volte l Ag) con l impiego di marcatori specifici

20 MARCATORI COMUNEMENTE USATI Isotopi radioattivi: impiegati in dosaggi radioimmunologici (RIA); Enzimi: impiegati in tecniche di immunochimica (ELISA); Fluorocromi: impiegati in tecniche di immunochimica (FIA) e di citofluorimetria (convenzionale od a flusso).

21 PROCEDURE IMMUNOCHIMICHE DIRETTE: viene marcato l Ac contro l Ag di interesse (Ac primario) INDIRETTE: viene marcato un Ac anti-ig che a sua volta si lega al complesso Ag-Ac

22 RIA (RadioImmunoAssay) Il radioisotopo maggiormente impiegato in tali metodiche per la marcatura di Ac e/o Ag e lo 125 I, un isotopo che emette radiazioni di facile rilevazione mediante scintillatori

23 CURVA DI TARATURA DI UN DOSAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO

24 MARCATURA CON ENZIMI Tale metodica trova impiego in diverse tecniche immunochimiche, quali ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay), Immunoblotting e Immunoistochimica; il legame tra l Ac marcato e l Ag viene visualizzato, eseguendo una reazione enzimatica che converte un substrato incolore in un prodotto colorato (solubile o insolubile)

26 IMMUNODOSAGGIO COMPETITIVO L Ag contenuto nei campioni da testare compete con una quantita fissa di Ag marcato, in presenza di una dose limitante di Ac; all equilibrio, l Ag libero viene separato da quello complessato e la quantita di Ag marcato presente nel complesso risulta inversamente proporzionale alla concentrazione di Ag nei campioni

27 IMMUNODOSAGGIO A DUE SITI: ELISA CATCHING (SANDWICH) In tali dosaggi l Ag si lascia reagire con l Ac immobilizzato su microsfere di agarosio o piastre di microtitolazione; l Ag legato viene poi rilevato con l eccesso di un altro Ac specifico per lag marcato con l enzima

29 IMMUNODOSAGGIO INDIRETTO: ELISA CLASSICA In tale metodica il campione da testare reagisce con l Ag immobilizzato precedentemente in un tubo di plastica o nei pozzetti di una piastra da microtitolazioni; l Ac, se presente, si lega all Ag e viene rivelato con Ac anti-ig marcati con enzimi

31 MARCATURA CON COMPOSTI FLUORESCENTI (FIA) I fluorocromi sono sostanze che emettono luce se illuminati con UV; in soluzione la fluorescenza degli Ac marcati con fluorocromi e quantificabile, utilizzando un fluorimetro. Esistono molti composti fluorescenti con diversi spettri di eccitazione e di emissione; tra i piu diffusi troviamo la fluoresceina (verde) e la tetrametilrodammina (rossa)

32 METODI DI IMMUNOFLUORESCENZA a: immunofluorescenza diretta b: immunofluorescenza indiretta c: metodo a sandwich semplice d: metodo a sandwich multiplo

33 CONFRONTO TRA DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO, RADIOIMMNOLOGICO ED IMMUNOLOGICO IN FLUORESCENZA

34 ENZYME MULTIPLIED IMMUNOASSAY TECHNIQUE (EMIT) A differenza dell ELISA, che è un dosaggio eterogeneo con allontanamento (lavaggio) dei reattivi marcati non legati, l EMIT è un dosaggio omogeneo.

35 CHEMILUMINESCENCE IMMUNOASSAYS (CLIA) Come l ELISA, la CLIA è un dosaggio eseguito in modalità eterogenea, cioè con l allontanamento (lavaggio) dei reattivi marcati non legati. ALP è la fosfatasi alcalina, un enzima capace di generare prodotti chemiluminescenti.

36 SURFACE PLASMON RESONANCE (SPR) La risonanza plasmonica di superficie (SPR) è il risultato dell eccitazione del plasmone di superficie (cioè onde elettromagnetiche) per mezzo della luce. Tale fenomeno è assai sensibile alla presenza di particelle (come le biomolecole) sulla superficie stessa, permettendo così di misurarne varie proprietà.

37 Dalle cinetiche di associazione e dissociazione a diverse concentrazioni di analita, si possono calcolare le costanti di associazione ka (on-rate) e dissociazione kd (off-rate) dell interazione con il ligando immobilizzato, la costante di affinità K D e la stechiometria del legame. I vantaggi della tecnica SPR per lo studio delle interazioni biomolecolari sono numerosi: L analisi si fa in tempo reale; la tecnica SPR non richiede l uso di campioni con fluorofori o tag; la sensibilità dell SPR consente di studiare l interazione di macromolecole con piccole molecole; l SPR consente di determinare le costanti cinetiche e di affinità, anche per interazioni deboli; la tecnica SPR fornisce anche informazioni stechiometriche e termodinamiche.

38 Pertanto, l SPR viene correntemente impiegata per: Caratterizzare la cinetica, l affinità e la stechiometria di un interazione; determinare la concentrazione di un componente in una miscela; realizzare studi termodinamici; studiare l effetto del mezzo su un interazione (ph, sali, additivi, etc.); effettuare screening e selezione di anticorpi, oltre a screening di supernatanti di ibridomi; eseguire il mapping di epitopi; eseguire il fishing di un ligando sconosciuto, ed altro ancora. Le interazioni più comunemente studiate includono: Anticorpo - Antigene Proteina - Proteina Proteina - DNA Proteina - Piccole Molecole (< 100 Da) Recettore di Membrana-Ligando Peptide - Recettore

39 Immunoblotting (impiega substrati enzimatici insolubili in acqua) Western blot (che vedremo in dettaglio) Dot blot

40 STEP 1 SDS-PAGE Proteins are separated based on their molecular weight. STEP WESTERN BLOT 2 TRANSFER Proteins are transferred on nitrocellulose or PVDF STEP 3 IMMUNODETECTION Proteins of interest are identified using specific antibodies

41 SDS-PAGE Western Blot Method Cell Removal Cell Lysis by Detergents and Sonication Cells in Culture Human Cells Containing Protein Heat Denaturation of Proteins Detergents Bind Proteins SDS or LDS Load Proteins on Gel - Apply Electric Current Proteins Separate by Size

42 Proteins are transferred on nitrocellulose or PVDF Blocking-Solution (usually TBST buffer skim milk 5%) Incubation in primary antibody Primary antibody recognizes the protein of interest Primary Ab a-actin (Ms) Ms: Ab developed in mouse - -