Microscopia a fluorescenza

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1 Microscopia a fluorescenza Ha permesso di osservare dettagli delle cellule vegetali, non distinguibili in campo chiaro GFP Ioduro di propidio

2 Il microscopio a fluorescenza (MF) Il MF è un microscopio ottico in grado di generare una radiazione luminosa monocromatica

3 Il microscopio a fluorescenza (MF) È un microscopio ottico modificato, che può operare anche in campo chiaro

4 Il microscopio a fluorescenza (MF) Microscopio ottico in campo chiaro Microscopio ottico a fluorescenza

5 Il microscopio a fluorescenza (MF) UV Spettro della luce emessa da una lampada a vapori di mercurio.

6 Il termine fluorescenza Deriva dal nome della fluorite (o fluoruro di calcio) Luce bianca UV Molti altri composti organici e inorganici possono emettere fluorescenza (fluorofori o fluorocromi)

7 I fluorofori I fluorofori, se esposti ad una radiazione di una determinata lunghezza d onda (radiazione incidente) emettono luce di un altra lunghezza d onda (fluorescono) UV Red radiazione incidente radiazione emessa Clorofilla

8 Struttura dei fluorofori La capacità di fluorescere è legata alla struttura chimica dei fluorofori, in particolare alla presenza di sistemi di doppi legami coniugati

9 Meccanismo della fluorescenza λ assorbita Calore λ emessa La radiazione emessa ha una lunghezza d onda maggiore (energia minore) rispetto alla radiazione incidente (parte dell energia viene dissipata come calore)

10 Spettri di assorbimento e di emissione Se si espone un fluoroforo a una gamma di lunghezze d onda crescenti, si può costruire uno spettro di assorbimento e uno spettro di emissione PA PE

11 spettri di emissione spettri di assorbimento Picchi di assorbimento e di emissione Ciascun fluoroforo è caratterizzato da un picco di assorbimento (max eccitazione) e da un picco di emissione (max emissione)

12 Autofluorescenza Molte molecole presenti nella cellula vegetale sono naturalmente fluorescenti, quindi per essere visualizzate con il MF non richiedono trattamenti

13 Fluorescenza secondaria Molte molecole presenti nella cellula vegetale non sono naturalmente fluorescenti e per essere osservate in fluorescenza devono essere rese fluorescenti: 1) Reagenti cito- e isto-chimici fluorescenti (es. DAPI e PI per gli acidi nucleici) 2) Anticorpi coniugati con fluorofori (immunofluorescenza) 3) Proteine fluorescenti (es. GFP) 4) Sonde di altro tipo (es. sonde ad RNA o DNA usate nell ibridazione in situ)

14 1) Reagenti cito-isto-chimici fluorescenti Il DAPI (4',6-diamidin-2-fenilindolo) è un agente intercalante del DNA, si fissa alla doppia elica in corrispondenza delle basi A e T

15 1) Reagenti cito-isto-chimici fluorescenti Lo ioduro di propidio si lega sia al DNA che al RNA Ioduro di propidio Per distinguere tra DNA o RNA occorre utilizzare delle nucleasi (che digeriscano l uno o l altro)

16 2. immunofluorescenza Anticorpi coniugati con fluorofori

17 Legame antigene-anticorpo L anticorpo riconosce e si lega a specifici elementi strutturali dell antigene dette epitopi Antigene = molecola target Epitopo = sito di legame dell anticorpo Anticorpo = immunoglobulina

18 Immunoglobuline Nella tecnica dell immunofluorescenza vengono utilizzate principalmente le IgG

19 Marcatura dell anticorpo Il primo passo consiste nella marcatura dell'anticorpo con un fluoroforo fluoroforo FAB (di riconoscimento) Catene pesanti FC (effettrice) Il fluoroforo deve essere legato alla zona FC poiché, se fosse legato alla zona FAB, l'immunoglobulina potrebbe perdere la sua funzionalità

20 Anticorpi policlonali e monoclonali Policlonali Diversi anticorpi prodotti da diverse plasmacellule Monoclonali Un solo tipo di anticorpi prodotti da un singolo clone plasmacellule

21 Anticorpi policlonali Antigene Si inietta l antigene in un animale da laboratorio Linfocita B I linfociti B riconoscono diversi epitopi dell antigene Plasmacellule Si formano diversi cloni di plasmacellule, ciascuno producente un anticorpo Rischio di falsi positivi per cross-reatività!

22 Anticorpi monoclonali Produzione di anticorpi monoclonali MONOCLONALI Prodotti da un unico clone di linfociti B Gli anticorpi riconoscono un unico epitopo Rischio di falsi negativi per denaturazione del sito antigenico

23 Immunofluorescenza diretta e indiretta DIRETTA: La marcatura viene effettuata sullo stesso anticorpo che riconosce l antigene della molecola target Molecola target Anticorpo primario Epitopo Fluoroforo

24 Immunofluorescenza diretta e indiretta INDIRETTA: L anticorpo primario riconosce l'antigene L anticorpo secondario marcato, riconosce l anticorpo primario Molecola target Epitopo 1 Anticorpo primario Anticorpo secondario marcato (anticorpo anti-anticorpo) Fluoroforo

25 Immunofluorescenza diretta e indiretta INDIRETTA: Uno dei principali vantaggi è dato dall amplificazione del segnale: ad un singolo epitopo possono legarsi numerosi anticorpi secondari Molecola target Anticorpo primario 1 Epitopo Segnale

26 3) Proteine fluorescenti GFP (Green Fluorescent Protein) Aequorea victoria GFP Il gene codificante la GFP è stato sequenziato negli anni 60 Nel 2008 i suoi scopritori sono stati insigniti del Nobel per la chimica

27 Principali caratteristiche di GFP Max abs 395 nm (UV) 27 KDa 238 aa Max flu 505 nm (verde) Max abs 475 nm (azzurro) La porzione fluorescente della molecola è parte della sequenza amminoacidica ed è posta al centro di una struttura cilindrica

28 Applicazioni di GFP Inizialmente il gene per GFP era utilizzata come reporter in esperimenti di trasformazione genica Attualmente è utilizzata principalmente per sviluppare costrutti genici in cui la sequenza codificante per GFP è affiancata ad altre sequenze

29 Osservazioni su organismi vivi Le proteine chimeriche fluorescenti sono fluorofori endogeni estremamente selettivi, poichè legati alla proteina di interesse Non essendo necessario alcun trattamento dei campioni, è possibile osservare in fluorescenza anche organismi vivi

30 Altre proteine fluorescenti GFP è il capostipite di un ampia gamma di proteine fluorescenti naturali: DsRed (da meduse del genere Discosoma). semisintetiche: EGFP (Enhanced GFP).. CFP (Cyan Fluorescent Protein). YFP (Yellow Fluorescent Protein) Attualmente si annoverano circa 60 proteine fluorescenti, ma questo numero aumenterà notevolmente nei prossimi anni.

31 Colorazioni combinate L uso combinato di più colorazioni complementari, vale a dire che emettano fluorescenza in zone diverse dello spettro, permette di realizzare una marcatura policroma e di evidenziare quindi strutture biologiche diverse in un medesimo campione Anti-tubulina FITC Sovrapposizione

32 4) Sonde di altro tipo: ibridazione in situ Le tecniche di ibridazione in situ permettono di rivelare sequenze specifiche di acidi nucleici (DNA e/o RNA) in cellule e tessuti morfologicamente conservati mediante l impiego di sonde geniche marcate con traccianti di diversa natura Sonda Cellula 1 Cellula 2 Target (DNA o RNA) Ibridazione

33 Ibridazione in situ Metodi diretti La molecola reporter (tracciante fluorescente) è legata alla sonda prima di effettuare l ibridazione Marcatura sonda Cellula 1 Cellula 2 Target (DNA o RNA) Ibridazione

34 Il bersaglio (RNA o DNA) viene ibridato con una sonda non marcata Dopo l ibridazione, il complesso target/sonda viene rivelato trattando il campione con reagenti specifici per la sonda Sonda non marcata Ibridazione in situ Metodi indiretti Cellula 1 Cellula 2 Target (DNA o RNA) Ibridazione

35 Applicazioni dell ibridazione in situ Le finalità della tecnica sono principalmente 2: 1. Se il target è un RNA, si può studiare l espressione di un gene a livello tissutale e cellulare 2. Se il target è il DNA, si può studiare la localizzazione di specifiche sequenze nucleotidiche sui cromosomi Sonda trascritto Sonda cromosoma cromosoma

36 Ibridazione in situ ed espressione genica In genere si usano delle ribosonde (sonde a RNA) marcate, complementari sugli RNA target (il legame RNA-RNA è molto stabile). Le sonde possono essere marcate con molecole fluorescenti (fluorofori) o con molecole colorate (cromofori)

37 Ibridazione in situ e mappatura cromosomica (FISH)

38 FISH: classificazione delle sonde

39 FISH: chromosome painting Sonde: collezione di frammenti specifici di un singolo cromosoma Cromosomi fluorescenti con colori diversi

40 Microscopia confocale Microscopio a fluorescenza Microscopio confocale Sorgente luminosa: LASER (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) Tutti i piani dell oggetto sono a fuoco

41 Microscopia confocale Microscopio a fluorescenza Microscopio confocale

42 Schema di un microscopio confocale Fotomoltiplicatore Pinhole di eccitaz. Pinole di emissione Specchio dicroico Fibre ottiche LASER Obiettivo Campione

43 Sezione ottica Il piano di messa a fuoco viene scansionato Per ciascun pixel vengono acquisite 3 informazioni: 1) Posizione sull asse X 2) Posizione sull asse Y 3) Intensità luminosa

44 Sezioni ottiche Helianthus annuus SEM

45 Ricostruzione tridimensionale Per ciascun voxel vengono acquisite 4 informazioni: 1) 2) 3)Posizione sugli assi X, Y e Z 4) Intensità luminosa

46 Ottenimento di sezioni del campione

47 Rappresentazione della tridimensionalità