Introduzione: gli anticorpi monoclonali

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1 Introduzione: gli anticorpi monoclonali I) Struttura e funzioni degli anticorpi Gli anticorpi - o immunoglobuline - sono delle glicoproteine sieriche prodotti da cellule della serie linfoide; appartengono alla classe delle γ-globuline e sono implicati nella Risposta Immunitaria umorale. Quando un antigene entra nell organismo, stimola il complesso sistema della risposta immunitaria. La risposta umorale rappresenta il primo meccanismo di difesa di tipo aspecifico che viene attivato dall individuo. Questa risposta comprende l attivazione di linfociti B selezionati i quali, a loro volta, secernono anticorpi in grado di interagire con il sito di legame anticorpale dell antigene detto epitopo o determinante antigenico. Il determinante antigenico, nel caso di un antigene proteico è una sequenza aminoacidica esposta dalla molecola antigenica che è in grado di essere riconosciuta in modo specifico dall anticorpo. La maggior parte di antigeni presenti in natura proteine, virus, batteri contengono centinaia, se non migliaia di differenti epitopi. Un tipico epitopo sulla superficie di una proteina comprende da cinque a sette residui amminoacidici. 1

2 Il legame antigene-anticorpo può ridurre o inattivare l attività biologica dell antigene soprattutto se si tratta di una tossina. La stabilità del legame dipende principalmente dal grado di specificità dell antigene nei confronti dell anticorpo e dalla affinità di legame. La struttura della molecola anticorpale fu identificata da G. Edelman e R.Porter ai quali, per questa scoperta fu conferito il Premio Nobel nel Una molecola di anticorpo è costituita da un nucleo strutturale simmetrico composto da due catene leggere (L) non glicosilate identiche e due catene pesanti (H) glicosilate, identiche anch esse. Figura 1 Schema anticorpo [9] Tutte queste catene sono tenute insieme sia da legami a idrogeno, che da ponti disolfuro (S-S) esattamente localizzati. In questo modo si può assicurare la stabilità della struttura anticorpale. Sia le catene leggere che quelle pesanti contengono una serie di unità omologhe di circa 110 aminoacidi che si ripiegano l una indipendentemente dall altra formando 2

3 una struttura globulare detta dominio immunoglobulinico. Un dominio è costituito da due strati di foglietti β planari. La simmetria della struttura immunoglobulinica anticorpale assicura la sua stabilità ed efficienza nella risposta immunitaria umorale. Tutte le molecole di un anticorpo presentano caratteristiche strutturali identiche, ma mostrano un estrema variabilità nelle regioni che legano l antigene. Sia le catene pesanti che quelle leggere, infatti, sono suddivise in una parte variabile (V) ed in una costante (C). Rispettivamente la regione variabile è presente nell estremità N-terminale e quella costante è localizzata nella zona C-terminale. Solamente i domini delle regioni variabili partecipano al riconoscimento del sito di legame con l antigene, È proprio questa variabilità che spiega la capacità delle diverse strutture anticorpali di legarsi ad un numero enorme di antigeni strutturalmente differenti. Ogni individuo possiede da 10 7 a 10 9 specie anticorpali ognuna delle quali è in grado di interagire con una sequenza aminoacidica unica presente nell antigene. che generalmente è composta da cinque a sette residui amminoacidici. Le regioni N-terminali delle catene L e H formano in ciascun anticorpo il sito di riconoscimento dell antigene. Il legame dell antigene da parte dell anticorpo avviene all estremità N delle due catene H e delle due catene L dove sono presenti tre regioni determinanti la complementarietà (CDR) collocate nelle regioni variabili V H e V L. Ciascuna di queste regioni consiste in una sequenza di 10 aminoacidi. Queste sono assemblate l una con l altra in una struttura tridimensionale a formare la regione di legame per il determinante antigenico. Le CDR rappresentano la parte della molecola anticorpale che presenta la massima variabilità. 3

4 II) Cenni sulla risposta anticorpale. La risposta umorale è la prima difesa dell organismo che si attiva quando in esso vi penetra un agente estraneo riconosciuto come non self. Nella risposta immunitaria umorale è coinvolto il linfocita B il quale matura nel midollo osseo a partire da una cellula staminale in assenza di stimolazione antigenica. Successivamente raggiunge gli organi linfoidi periferici e tra questi la milza, dove interagisce con antigeni presenti nel circolo sanguigno. I linfonodi, a questo punto drenano gli antigeni penetrati attraverso la cute, gli epiteli o le mucose. Un linfocita B che precedentemente non è stato mai coinvolto in una risposta immunitaria detto anche linfocita B vergine viene esposto all antigene il quale interagisce con le IgM ed IgD di membrana. La cellula B viene attivata e matura in plasmacellula che è in grado di secernere anticorpi. La risposta anticorpale convenzionale è detta policlonale per il fatto che le plasmacellule producono diversi tipi di anticorpi in risposta ai differenti determinanti antigenici che caratterizzano un singolo antigene. [35] 4

5 Figura 2 La risposta anticorpale policlonale Gli anticorpi secreti in vivo in risposta alla immunizzazione con uno o più antigeni sono policlonali, per il fatto che vengono stimolate diverse cellule B che riconoscono regioni o epitopi differenti sull antigene immunogeno. Si ha, pertanto una risposta anticorpale eterogenea. Le applicazioni in vivo degli anticorpi policlonali sono state utilizzate per decine di anni per indurre un immunizzazione passiva contro malattie infettive e altri agenti dannosi, in particolare tossine. Una singola molecola di anticorpo è specifica per un unico tipo di determinante antigenico, ma in un singolo voluminoso antigene posso coesistere molti determinanti diversi e, per questo motivo vengono sintetizzati differenti popolazioni di anticorpi. Ciascun linfocita B di mammifero ha il potere di produrre un singolo clone cellulare che, a sua volta, secerne un unico tipo di anticorpi che sono detti per l appunto monoclonali. Una risposta anticorpale monoclonale, al contrario di quella policlonale può essere indotta solo artificialmente in un organismo; generalmente viene effettuata con scopi sperimentali, in quanto non potrà mai accadere in vivo che la presenza di un antigene stimoli un singolo clone a produrre uno specifico anticorpo monoclonale diretto verso uno dei tanti determinanti antigenici caratterizzanti la molecola antigenica. 5

6 Figura 3 Selezione degli anticorpi monoclonali a partire da linee policlonali Per ottenere un ampia popolazione di plasmacellule che producano tutte lo stesso anticorpo si deve indurre la moltiplicazione di un linfocita in una coltura pura. 6

7 Figura 4 La risposta anticorpale in un topo [4] 7

8 III) Cenni storici I progressi nelle tecniche di coltura cellulare, l ampliamento dei campi di ricerca dell immunologia, le aumentate conoscenze sulle tecniche impiegate per il DNA ricombinante, l uso della cristallografia a raggi X e l impiego di topi transgenici e topi knockout, hanno posto le basi per la progettazione della tecnica di produzione di una quantità illimitata di molecole anticorpali identiche tra loro e specifiche per un certo determinante antigenico. Furono i ricercatori Köhler e Milstein nel 1975 a scoprire per primi questa semplice, ma rivoluzionaria tecnica. [2] Essi dimostrarono che la fusione di cellule linfocitarie di topo immunizzato capaci di produrre anticorpi, con cellule di mieloma murino, consentiva di ottenere una nuova linea cellulare definita come ibridoma, in grado di crescere con la stessa efficienza della linea mielomatosa e, al tempo stesso, di produrre l anticorpo originariamente espresso dal linfocita. L ibridoma si prestava, inoltre, ad essere coltivato su larga scala. Negli anni successivi, numerosi altri ricercatori hanno effettuato innovazioni tendenti a migliorare gli aspetti metodologici che hanno permesso una più precisa e veloce razionalizzazione dell utilizzo di anticorpi e di immuno-reagenti. 8