ANTICORPI. Il termine anticorpo si riferisce alla proprietà di riconoscere in maniera specifica i corpi estranei (antigeni).

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1 ANTICORPI Il termine anticorpo si riferisce alla proprietà di riconoscere in maniera specifica i corpi estranei (antigeni). H L Fab Fab H L Fc Vari frammenti proteici degli anticorpi possono essere utilizzabili in diverse circostanze e vengono prodotti individualmente mediante proteolisi enzimatica oppure con le tecniche del DNA ricombinante. Le piccole dimensioni migliorano le proprietà di diffusione e penetrazione (es. marcatori tissutali). Modifiche post-traduzionali e ponti disolfuro sono fondamentali per l attività delle molecole anticorpali quindi è importante la modalità di produzione e purificazione degli anticorpi stessi.

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3 GLOSSARIO Antisiero policlonale: miscela eterogenea di anticorpi che si trova nel siero derivato da un animale immunizzato. Anticorpo monoclonale: anticorpo prodotto da una linea cellulare clonale in coltura. Ben definito e con caratteristiche prevedibili. Anticorpi umanizzati: anticorpi murini in cui molte sequenze di topo sono sostituite con omologhe sequenze umane al fine di ridurre l immunogenicità degli anticorpi monoclonali nell uomo.

4 PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI

5 PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI. Tipizzazione tissutale Reagenti precisi per ricerca Analisi sierologiche Manipolazione risposte immunitarie Trattamento malattie autoimmuni Applicazioni degli anticorpi monoclonali Diagnosi ed epidemiologia agenti infettivi Identificazione dei prodotti dei geni oncogeni Potenziamento del rigetto tumorale Diagnostica tumori e metastasi in vivo Purificazione sostanze presenti in microquantità Le potenziali applicazioni degli anticorpi monoclonali rappresentano ad oggi uno dei settori cardini delle biotecnologie, che possono essere ulteriormente sviluppate mediante le tecniche da DNA ricombinante grazie alla produzione di anticorpi con nuove funzioni effettrici, i cosidetti immunoconiugati.

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8 Anticorpi monoclonali umanizzati vs Anticorpi monoclonali murini Perchè un anticorpo monoclonale sviluppi appieno il suo potenziale terapeutico sull'uomo, è indispensabile che sia di origine umana. Questo ovviamente perchè l'anticorpo è esso stesso un antigene. Anticorpi monoclonali murini complessa risposta anti-topo (produzione HAMA) potenziale terapeutico e fenomeni di ipersensibiblità nell uomo no immunoterapia! Strategia anticorpi chimerici uomo-topo, prodotti per ricombinazione a livello genico dei domini variabili murini, corrispondenti alla specificità selezionata, con domini costanti umani anticorpi umanizzati scelta dell isotipo a seconda dell'utilizzo clinico e nessuna risposta immunitaria della regione costante umana produzione laboriosa e richieste grandi quantità.

9 PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI DA IBRIDOMI Topo inoculato con l antigene opportuno Plasmacellule isolate dalla milza Cellule di mieloma coltivate in vitro Fusione cellulare in presenza di PEG Selezione e clonaggio degli ibridomi milzamieloma Cloni che producono un unico tipo di anticorpo Anticorpi monoclonali dal terreno di coltura

10 LINEE CELLULARI DI MIELOMA Nessuna produzione immunoglobuline. Mancata espressione del gene per l enzima HGPRT (ipoxantina guanina fosforibosil transferasi) coinvolto nel metabolismo dei nucelotidi.

11 SELEZIONE DEGLI IBRIDOMI E necessario creare condizioni di coltura in cui solo gli ibridomi siano capaci di sintetizzare il DNA. SISTEMA HAT (ipoxantina-aminopterina-timidina) Condizioni di coltura in cui solo le cellule ibride riescono a sintetizzare il DNA e percio' ad andare incontro a divisioni cellulari. Le cellule non ibride sono incapaci di sintetizzare DNA e vanno perse. La sintesi di DNA è condizionata alla presenza di NTP (deossipurin- e pirimidin- trifosfati) sintetizzati a partire dai rispettivi monofosfati. I NTP si formano da: SINTESI DE NOVO dai precursori più semplici VIE DI SALVATAGGIO gli enzimi riciclano purine e pirimidine prodotte dalla degradazione di DNA e RNA.

12 HAT: H=ipoxantina L'ipoxantina è usata come una sorgente esterna di purine poichè essa è fosforilata dall'enzima ipoxantina guanina fosforibosil transferasi (HGPRT) a formare IMP che, alternativamente, può essere convertito a AMP e GMP. (HGPRT) Enzima assente nelle cells mieloma Unica via = sintesi de novo dei nucleotidi (IMP) AMP,GMP

13 HAT: A= aminopterina L'aminopterina blocca tutte le reazioni dell'enzima diidrofolato reduttasi che è coinvolto nella sintesi de novo di IMP (e di qui tutte le purine) e anche nella metilazione di dump a formare dtmp. Di conseguenza, la cellula diventa completamente dipendente dalla via di salvataggio per produrre i trifosfati purinici e pirimidinici per la sintesi del DNA. METILAZIONE dump A dtmp dump Timidilato Sintasi dtmp PLP DHPR Aminopterina SINTESI DE NOVO IMP E PURINE Tetraidrofolato (coenzima) AMP IMP GMP

14 HAT: T=timidina La timidina usata come sorgente esterna, è fosforilata dalla timidina chinasi (TK) per formare TMP. TK + ATP + ADP TK: timidina chinasi Timidina TMP

15 riepilogando Le cellule ibride formate per fusione di plasmacellule con cellule di mieloma hanno la sintesi de novo bloccata da aminopterina ma grazie ai cromosomi di topo hanno l'hgprt e possono recuperare le purine per formare purin monofosfati dall'ipoxantina, e grazie a TK possono sintetizzare dalla timidina i pirimidin monofosfati. Quindi solo queste cellule ibride riescono a crescere e a dividersi in presenza di HAT. HGPRT MUOIONO in HAT Cell Mieloma Milza-mieloma Cell Milza Le plasmacellule MUOIONO per apoptosi SOPRAVVIVONO solo le cell IBRIDE che hanno ricevuto dal topo il gene per l enzima HGPRT

16 Es. ELISA Verifica della positività 1. Titolo anticorpale basso: nuova immunizzazione 2. Titolo anticorpale alto: propagazione ibridomi

17 Sistemi selettivi per l isolamento di ibridomi: clonaggio su feeder layer Scopo = ottenimento di colture cellulari provenienti dall espansione clonale di una singola cellula. Feeder layer: Cellule di supporto (es. macrofagi murini) con la funzione di condizionare il terreno di coltura e permettere la crescita di ibridomi in condizioni di bassa concentrazione. Clonaggio in agar Clonaggio in diluizione limite

18 Sistemi selettivi per l isolamento di ibridomi: clonaggio su feeder layer in agar Semina su agar di singole cellule di ibridoma (diluizioni) con la propagazione dei singoli cloni visualizzati al microscopio. Ottenuta la crescita clonale per stratificazione con antisiero specifico si formerà un immunoprecipitato intorno ai singoli cloni che ne consentirà il prelievo.

19 Sistemi selettivi per l isolamento di ibridomi: clonaggio su feeder layer in diluizione limite Mediante microscopia in piastre a 96 pozzetti il clone madre è diluito (circa 60 cells per piastra ossia 1-5 cells per pozzetto) e distribuito. Dopo 3 giorni si osserva la presenza di piccoli cloni di cellule di ibridomi in ciascun singolo pozzetto (elevata possibilità di origine dei cloni da un unica cellula).

20 PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI DA COLTURE DI CELLULE ANIMALI

21 PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI DA COLTURE DI CELLULE ANIMALI 1. Immunizzazione dell animale con l antigene specifico 2. Formazione e selezione degli ibridomi (mieloma cells/milza cells) 1. Terreno HAT 2. Crescita giorni (sopravvivenza dei soli ibridomi) 3. Trasferimento in coltura HAT 3. Identificazione delle cellule ibride che producono l anticorpo specifico 1. Immunodosaggio (ELISA assay) 2. Isolamento degli ibridomi (feeder layer) 3. Ottenimento dei cloni (immunodosaggio finale) e mantenimento dei cloni 4. Fermentazione degli ibridomi

22 TERRENO HAT H: IPOXANTINA Substrato enzima HGPRT Attivazione via di salvataggio A: AMINOPTERINA Inibitore enzima DHPR Blocco sintesi de novo T: TIMIDINA Substrato enzima TK Attivazione via di salvataggio IMP TMP AMP GMP Conclusioni: 1. L Aminopterina blocca la sintesi de novo unica via attiva per la sintesi del DNA nelle cellule di mieloma (HGPRT difettose) che quindi non crescono; 2. Ipoxantina e Timidina rappresentano le fonti esterne delle via di salvataggio per la sintesi del DNA consentendo la crescita selettiva delle cellule di ibridoma.

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