Immunologia e Immunologia Diagnostica TECNICHE IMMUNOLOGICHE

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Luciana Manzi
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1 Immunologia e Immunologia Diagnostica TECNICHE IMMUNOLOGICHE

2 Tecniche di laboratorio La maggior parte delle tecniche di laboratorio biomedico si basano sull utilizzo degli anticorpi. Gli anticorpi sono utilizzati come reagenti ad elevata specificità. Gli anticorpi possono essere prodotti per riconoscere ogni tipo di molecola biologica o chimica: - Proteine - Acidi nucleici - Lipidi - Polisaccaridi - Sostanze chimiche

3 Applicazioni degli anticorpi monoclonali Gli anticorpi monoclonali sono attualmente utilizzati: - Nei laboratori di ricerca biologica e biomedica - Nei laboratori di diagnostica - Nelle terapie mediche Gli anticorpi monoclonali permettono di: - Determinare la presenza di un antigene (Test qualitativo) - Misurare la quantità di un antigene (Test quantitativo) - Purificare l antigene desiderato (Molecole o Cellule Intere)

4 Concetto di antigene nelle applicazioni pratiche Dal punto di vista biologico l antigene è sempre una molecola riconosciuta da un anticorpo, ma diventa utile per individuare/quantificare cellule, batteri, virus e molte sostanze presenti nel sangue: Marker CD = Linfociti e altre cellule del sangue Ag batterici e virali = 1. Immunodiagnosi per infezioni 2. Titolo anticorpale Marker tumorali = Diagnostica per immagini Proteine del sangue = Diagnostica di laboratorio clinico

5 Proprietà pratiche nell utilizzo degli anticorpi Il riconiscimento dell antigene da parte di un anticorpo è basato su legami chimici che determineranno: L affinità dell anticorpo L avidità dell anticorpo La specificità dell anticorpo

6 Reazioni Antigene (Ag)/Anticorpo (Ab) Modello Chiave-Serratura Interazione Lisozima/Anti-Lisozima Legami non covalenti: Ag Legami Idrogeno Legami Elettrostatici Legami Idrofobici Molti legami tra Ag e Ab Processo Reversibile H L

7 Affinità Anticorpale La forza della reazione tra un singolo determinante antigenico ed un singolo sito di legame dell anticorpo Alta Affinita Ab Bassa Affinita Ab Ag Ag Affinita = Somma delle forze attrattive e repulsive

8 Avidità Anticorpale La forza totale del legame tra un Ag con molti determinanti e Abs multivalenti K eq = 10 4 Affinita 10 6 Avidita Avidita

9 Specificità Anticorpale La capacita per un singolo anticorpo di reagire contro un solo determinante antigenico. La capacita per una popolazione di anticorpi di reagire contro un solo antigene.

10 Reazione Incrociata (Cross-Reazione) La capacita di un singolo anticorpo di reagire contro piu determinanti antigenici. La capacita di una popolazione di anticorpi di reagire contro piu antigeni. Cross-Reazioni Anti- A Ab Anti- A Ab Anti- A Ab Ag A Ag B Epitopo condiviso Ag C Epitopo simile

11 Test Basati sulle Reazioni Ag/Ab Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab permettono di misurare piccole quantita degli immuno-complessi. Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab possono essere utilizzati per misurare l antigene o l anticorpo presenti nel campione.

12 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Saggio di Immunoassorbimento Legato ad Enzima

13 Principio dell ELISA 1 componente (Ag o Ab) immobilizzato su piastra 1 componente (Ag/ Ab / Anti-Ig) marcato con enzima L enzima (perossidasi) reagisce con il substrato La reazione produce una colorazione misurabile Substrato incolore Substrato dopo la reazione Anti-Ig marcato Enzima Ab specifico Piastra ELISA Ag

15 ELISA Diretto per Ag Rilevamento dell Ag Immobilizare l Ab Incubare con il campione da misurare Aggiungere l Ab marcato con un enzima La quantita di Ab legato e proporzionale alla quantita di Ag nel campione del paziente. Ag nel campione del paziente Immobilizato Ag Fase Solida Ab marcato Test Quantitativo

16 ELISA Diretto per Ab Rilevamento dell Ab Immobilizare l Ag Incubare con il campione da misurare Aggiungere l anti-ig marcato con un enzima La quantita di anti-ig legato e proporzionale alla quantita di Ab nel campione del paziente. Ab nel campione del paziente Immobilizato Ag Fase Solida Anti-Ig marcato Test Quantitativo

17 Immunofluorescenza e Citofluorimetria

18 Immunofluorescenza Preparazione dei campioni Accessibilita Ag Antigeni sulla membrana citoplasmatica: - direttamente accessibili Antigeni intracellulari: - inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione

19 Immunofluorescenza Preparazione dei campioni Marcatura Ab Traccianti Fluorescenti: -1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag - Fino a 4 traccianti diversi per un campione

20 Fluorescenza e Fluorocromi I fluorocromi sono molecole utilizzate come coloranti fluorescenti: -Assorbono l energia della luce Eccitazione -Emettono fluorescenza nel visibile Emissione Fluorocromo Eccitazione (nm) Emissione (nm) Fluoresceina (FITC) Rodammina Ficoeritrina (PE) Texas Red

21 Immunofluorescenza Diretta: - L anticorpo che riconosce l antigene e marcato con un fluorocromo (molecola fluorescente) Ab marcato con fluorocromo Ag Sezione di un tessuto

22 Immunofluorescenza Indiretta: - L Ab che riconosce l Ag non e marcato - Viene utilizzato un anti-ig marcato con un fluorocromo per rilevare il legame del primo Ab. Ab non marcato Ag Anti-Ig marcato con fluorocromo Sezione di un tessuto Test Qualitativo/Semi-Quantitativo

23 Immunofluorescenza Area T (Paracorticale) Area B (Follicoli) Linfociti T e B all interno di un linfonodo

24 Immunofluorescenza Analisi di Tessuti Analisi di Singole Cellule

25 Citofluorimetria Preparazione dei campioni Accessibilita Ag Antigeni sulla membrana citoplasmatica: - direttamente accessibili Antigeni intracellulari: - inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione

26 Citofluorimetria Preparazione dei campioni Marcatura Ab Traccianti Fluorescenti: -1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag - Fino a 8 traccianti diversi per un campione

La marcatura avviene con Fluorescenza Diretta o Indiretta.

27 Citofluorimetria La sospensione di cellule da analizzare viene marcata con una molecola fluorescente. La marcatura avviene con Fluorescenza Diretta o Indiretta. Il campione di cellule viene analizzato con un citofluorimetro (FACS)

di Cellule Cellule fluorescenti Intensita Fluorescenza Verde

29 Citofluorimetria Analisi del campione al FACS Istogramma con 1 Parametro Istogramma con 2 Parametri Cellule non marcate Numero di Cellule Cellule fluorescenti Intensita Fluorescenza Verde Intensita Fluorescenza Verde Intensita Fluorescenza Rossa

30 Citofluorimetria Esempio: Analisi cellule da sangue periferico - Miscela di linfociti, monociti e granulociti - Colorazione con Ab monoclonali: 1) Anti-CD14 (specifico per monociti) marcato con ficoeritrina (PE) 2) Anti-CD45 (presente su tutti i leucociti: linfociti>monociti>granulociti) marcato con fluoresceina (FITC)

31 Citofluorimetria Esempio: Analisi cellule da sangue periferico con 1 parametro CD45 FITC CD45=linfociti>monociti>granulociti (1) (2) (3) CD14 PE CD14=monociti Intensita Fluorescenza

32 Citofluorimetria Esempio: Analisi cellule da sangue periferico con 2 parametri CD14=monociti CD45=linfociti>monociti>granulociti CD14 PE CD45 FITC R1=monociti (CD14+) R2=linfociti (CD45>monociti) R3=granulociti (CD45<monociti)

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